核酸酶是所有可以水解核酸的酶。根据核酸酶底物的不同可将其分为DNA酶和RNA酶。依据按对底物作用方式可将核酸酶分为外切酶和内切酶。核酸外切酶是从多核苷酸链末端开始，逐个地将核苷酸切下，从而使核酸降解；DNA 外切酶又分为 3′-和 5′-外切酶，分别从两端沿 3′→5′或 5′→3′方向切割。 有些DNA聚合酶也有外切酶活性，在DNA复制过程中既可以切除错配的碱基，还可以保证DNA生物合成的精确性。而内切核酸酶只在DNA或RNA分子内部切断磷酸二酯键。有些核酸内切酶要求酶切位点必须具有核酸序列的特异性，称为限制性核酸内切酶。大多数限制性核酸内切酶识别的位点通常为5或4碱基序列，识别的序列为回文结构；有些核酸内切酶没有序列特异性的要求。根据核酸酶对底物二级结构的特异性，作用于双链核酸的叫双链酶，作用于单链的叫单链酶。