免疫测定的首要前提是获得针对待测物靶分子的特异抗体，该抗体与抗原表位识别和结合的特性是测定性能的决定性因素；如需测定的是抗体，则需制备相应的特异抗原物质，抗原所包含的表位数量及其与待测抗体的反应特性是测定性能的决定性因素。由于抗原通常包含多个表位，抗体检测靶分子通常是一组针对相互关联的抗原表位的不同抗体所组成的抗体谱，检测方法对于特异抗体的检出效能主要取决于所用试剂抗原是否完整包含各表位以及抗原与抗体比例。

狭义地讲，在免疫测定中，抗原是指与抗体特异性结合并能被检测的物质。此处所指抗原多数是蛋白质和多肽类，也可以是多糖、脂类和核酸及其复合物等。此外，氨基酸及其衍生物的单体分子等也可作为抗原加以检测，但检测方法与大分子测定所用技术不同。

同时具有免疫原性和免疫反应性的物质称为完全抗原。

只有免疫反应性而无免疫原性的物质称为半抗原。半抗原与生物大分子或高分子材料等通过体外人工操作形成半抗原-载体复合物后，可能获得新的空间构象，该人工合成分子能成功诱导免疫应答，产生特异的针对半抗原的抗体。

免疫测定中所用的抗原可分为天然抗原、合成多肽抗原和基因重组抗原。

天然抗原通常取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能使用，如从HBsAg高滴度携带者外周血中分离纯化的HBsAg等。天然抗原的特点是所有的表位都未受到破坏，完全保留了天然抗原所具备的抗体结合特性，但天然抗原的纯度对相应的免疫测定方法的特异性有较大影响。

合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原表位的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成多肽抗原一般只含有一个抗原表位，纯度高，特异性强，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相载体上，一般需借助偶联物间接结合到固相载体表面。合成多肽抗原缺乏完整抗原所具有的立体构象表位，用于相应的抗体检测有可能导致结合于这种立体构象表位的抗体漏检。

基因重组抗原是在己知目的抗原基因的基础上，采用基因工程技术表达目的抗原。基因重组抗原不但对原抗原的生物学和免疫学特性能最大限度的保留，而且可大量生产，同时没有从生物组织或体液中提纯抗原所存在的传染危险性。但如果采用的是原核表达的蛋白，则与天然蛋白有一定区别，因为原核表达体系不能对蛋白质进行糖基化修饰，会导致部分表位的不同或缺失。目前商品化的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒基本上使用重组抗原。

免疫原性指抗原被APC、T、B细胞等识别并诱导机体产生相应体液和细胞适应性免疫应答的属性。抗原的免疫原性与抗原的来源、分子大小和组成及空间构象、数量、机体的内环境等因素有关。

抗原可以是非己物质，也可以是自身组分。外来抗原与宿主的亲缘关系越远，通常免疫原性越强。免疫测定中使用的特异性抗体，通常是将病原体抗原成分或人体组织抗原成分经人工合成或纯化后，将其与佐剂共同免疫实验动物，如家兔、小鼠、羊、马等。

大分子天然抗原如蛋白质和多肽类分子的免疫原性较强；抗原分子量大且空间构象越复杂，则免疫原性也越强。分子组成复杂程度决定抗原空间构象的复杂程度和多样性，分子组成过于简单时免疫原性较弱。

通常抗原分子的数量较多，其免疫原性也较强。若抗原分子数量过少，或其抗原表位未能充分暴露，则免疫原性较弱。抗体试剂制备过程中使用佐剂的目的，是确保抗原不会因为机体代谢系统和免疫系统快速清除抗原，导致与免疫系统接触的抗原数量相对或绝对不足而影响抗体和免疫活性细胞的产生。但是另一方面，抗原数量过多可诱导免疫耐受。

这些因素包括MHC基因、年龄、性别与健康状态等。因此，选择合适的动物种类用于制备检测试剂非常重要，应挑选发育成熟而健康的动物。此外，为制备抗体试剂而免疫动物时，通常选择皮内和皮下注射的途径，肌内注射次之。

免疫反应性指抗原分子与免疫球蛋白分子发生特异性识别和结合的属性。在免疫测定中，免疫反应性是检测的基础。抗原与抗体结合的本质是抗原表位与抗体独特型（idiotype）在空间构象相互适宜的基础上，通过相应基团上原子的电子云相互作用形成氢键、离子键和疏水键等非共价键而形成抗原抗体复合物。免疫反应是一种可逆的双向反应，不同的反应条件如pH、离子强度、温度等都会影响反应的平衡以及达到平衡所需时间。

免疫测定中的抗原可以有多种存在方式。游离抗原可以直接与抗体结合，固相包被的抗原以及细胞膜表面的抗原也可以直接被抗体识别，而位于细胞内的抗原则需要通过预处理，使抗原暴露出来或采用适当的方法增加细胞膜的通透性，使试剂抗体分子可以进入细胞后，才能发生抗原与抗体的结合。此外，对于石蜡包埋的组织，需要预先进行脱蜡和水化，之后其中的抗原才能与抗体结合。某些含较多酯类基团的抗原分子，则需要反应体系中含有一定的脂质成分帮助抗原维持相应的结构，以便抗体分子进行识别、结合。

免疫学检测中抗原与抗体反应的主要基础是两者结合的特异性。抗原的特异性分为两种，即免疫原性的特异性和免疫反应性的特异性，前者指抗原刺激机体产生针对该特定抗原相关表位的特异的细胞和（或）体液免疫应答；后者指抗原只能与其诱导产生的抗体产生特异的结合反应。

免疫检测中的抗原特异性主要取决于抗原分子所含的表位（epitope），又称抗原决定簇（antigenic determinant）。抗原表位的数量和空间构象上的分布位置影响免疫测定方法的性能。例如，采用双抗体夹心法检测抗原时，抗原表位就必须考虑包被于固相的抗体和标记抗体与抗原结合部位可能存在的空间位阻问题，假如两种抗体所针对的抗原表位空间构象离得太近，则一种抗体可能会由于空间位阻而干扰另一抗体的结合，导致抗原和抗体的结合不能充分达到平衡，更容易受到反应条件的影响而引入偶然误差，导致检测的结果重复性较差。

此外，由于抗原表位的特异性很大程度上依赖于其空间构象，而空间构象绝大多数是由非共价键所维持，因此，当环境因素破坏了非共价键、改变了抗原表位的空间构象时，就会对抗原抗体结合的特异性、反应速度、生成抗原抗体复合物的速度以及复合物解离的速度平衡、抗体对抗原的亲和力等诸多方面产生显著影响，从而使检测的灵敏度、特异性和重复性等性能发生明显变化。

此外，抗原免疫动物制备抗体时，需要确保此时的抗原表位构象与待测物抗原相同，而选择适宜的动物品系和采用恰当的方法进行免疫，也是十分重要的。不同分子组成的抗原对制备抗体的动物、佐剂、免疫次数和抗原用量、免疫部位等都有特殊的要求。

不同种属和地区的人群的某些抗原分子具有不同的分子组成，因而其虽然具有相同的名称，但其抗原性存在差异。另外，随着时间的推移，一些抗原如某些病毒的抗原组分，由于自身较易发生突变导致编码蛋白的改变，还会因为抗病毒药物或抗生素的使用而发生诱导突变，导致抗原性的改变，这也是微生物以变异并借此逃避宿主免疫系统攻击而获得生存的策略。

此外，某些抗原可以通过基因突变或重组或融合等方式而发生改变，当其累及具有重要功能的基因时，往往引起相关分子功能的明显改变，并可能导致相应的临床症状，是重要的疾病发病机制。此时，虽然抗原分子的一部分仍保留，但分子中引入了新的组分，使抗原性质变化得较为复杂，这种抗原用于免疫测定有可能会引入较多误差。

免疫测定中所用的抗体可分为多克隆抗体（polyclonal antibody，pAb）、单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）和基因工程抗体（genetic engineering antibody）。

用抗原免疫实验动物，经适当的途径可以获得含有特异性抗体的动物血清，称为抗血清（antiserum）。由于免疫原通常有多个具有免疫原性的表位，因此，血清中的抗体是由多个抗原表位刺激不同B细胞并通过其母细胞化形成浆细胞克隆后而产生的混合抗体，是多种单克隆抗体的混合物，因此称为多克隆抗体。多克隆抗体制备方法较为简单、亲和力通常较高，可针对抗原的多个表位同时进行结合；但抗血清也存在缺点，即抗体组成较为复杂、易发生交叉反应，且每次制备的抗体在其亲和力上存在一定差异。

由免疫原免疫动物后，经适当的方法进行筛选和克隆增殖后，来源于单一克隆的杂交瘤细胞所产生的、针对某单一抗原表位的特异性抗体称为单克隆抗体，其优点是结构均一、抗体纯度高、较少发生交叉反应。当然，只针对同一个抗原表位发生结合反应也是单克隆抗体的弱点。需要注意的是，在采用双抗体夹心法测定抗原时，用于固相包被的单克隆抗体和液相标记的单克隆抗体必须针对不同的抗原表位，否则将无法成功建立方法，因为抗原表位只能被包被抗体或标记抗体中的一种所结合。当然，如果同一抗原分子中含有多个相同表位时，则不受此限制。实际使用中，为了提高抗原结合的容量或载量，包被抗体可采用多个单克隆抗体的复合物，从而使固相抗体在免疫测定中能更完全地结合待测标本中的特异抗原。此外，选择抗体时，还应注意避免选择空间结构上过于接近的两个抗原表位作为靶点，因为两种抗体的结合会发生相互干扰。

基因工程抗体又称重组抗体，是指利用基因工程技术对编码抗体的基因按实际需要，通过分子生物学方法进行重组，经筛选、鉴定、体外大量表达，获得具有针对相应抗原表位的特异性反应能力的抗体。迄今已成功制备的基因工程抗体包括人源化抗体、小分子抗体和双特异性抗体等。

抗体的抗原结合部位由抗体分子重链高变区VH和轻链高变区VL上各自的三个超变区组成，该部位形成一个与抗原表位互补的沟槽样空间结构，该区域即独特型，决定了抗体分子结合抗原的特异性。

不同种类、数量和存在方式的抗原分子，其刺激宿主B细胞所产生的免疫球蛋白分子在种类、数量、特异性以及亚型等方面均不尽相同，呈现明显的多样性。自然界中抗原种类繁多、分子结构复杂，每种抗原常含有多种表位。这些抗原刺激机体产生的抗体存在不同特点，首先是针对各抗原表位产生相应特异性抗体，与此同时，针对同一抗原表位所产生的可以是不同类型的抗体。因此，机体对所有目前已知的抗原所产生的抗体，理论上是一组数量、种类、组成极为庞大的异质性抗体的总和。免疫测定方法的优劣在很大程度上有赖于是否获得优质的和大量的抗体，尤其是IgG类抗体，这就需要在免疫原制备、免疫方法的选择、抗体的筛选和纯化、抗体鉴定、大量制备等方面进行不断的优化和改进。

抗体的化学性质是蛋白质，故在某些情况下其本身也具有免疫原性，可激发机体产生特异性免疫应答。抗体具有免疫原性的基础在于抗体分子中包含不同种类的抗原表位。这些抗原表位的免疫原性在种系角度可以表现为三种不同类型的血清型，即同种型、同种异型和独特型。举例说明，运用同种型抗原免疫宿主动物可以获得针对该类抗原同种型表位的相应抗体，因此，可以使用小鼠的IgG免疫家兔，产生兔抗小鼠IgG的第二抗体，家兔的这种针对小鼠IgG特异性抗体也称为抗抗体。类似地，使用该策略也可产生山羊抗兔或小鼠IgG的第二抗体。目前这些抗抗体在临床免疫测定中是常用的检测试剂，常被用于标记不同的示踪剂后作为通用标记抗体。

抗体能特异地识别抗原并与之结合，这种特性是免疫学检测方法建立的基础。抗原与抗体结合除了空间构象互补外，抗原表位与抗体独特型必须紧密接触，才可能使基团之间有足够接近的距离以形成多种非共价键，形成足够大的结合力。抗原与抗体之间的结合力主要包括静电引力、范德华引力、氢键和疏水键。

静电引力（electrostatic force）是指抗原与抗体上带有正负相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的作用力。抗体和大多数抗原是蛋白质，在一定的pH的电解质环境中，蛋白质表现为两性分子，其氨基和羧基会电离形成带阳性电荷的氨基和阴性电荷的羧基，因此抗原和抗体相对应的不同电荷的基团之间可以相互吸引，促进抗原与抗体通过离子键发生结合。静电引力的大小与两个电荷间的距离的平方成反比，即两个电荷间的距离越接近，静电引力越强。

范德华力（van de Waals force）是抗原与抗体相互接近时，两种分子发生极化作用而形成的一种吸引力。范德华引力的大小与抗原抗体相互作用基团的极化程度的乘积成正比，与两个基团之间距离的七次方成反比。确保这种引力发挥最大作用的关键，是抗原抗体分子空间构型的互补，抗原与抗体活性部位的相互作用即可产生最强的范德华力。范德华引力的作用强度小于静电引力。

氢键（hydrogen bond）是由抗原分子中的氢原子与抗体分子中电负性大的原子如氮、氧等相互作用而形成的引力。当具有亲水基团（如羟基、氨基和羧基）的抗原与相对应的抗体接近时，相互间可形成氢键而使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范德华引力强，因其需要供氢体和受氢体的互补才能实现氢键结合，因此，氢键对抗原抗体结合的特异性十分重要。

在水溶液中，抗原和抗体之间的疏水基团相互接触，对两种分子间空隙中的水分子发生挤压和排斥而趋向聚集的力称为疏水作用力（hydrophobic interaction）。当抗原表位与抗体结合区域相互靠近时，分子相互间正、负极性消失，由于静电引力形成的亲水层也立即失去，排斥了两者间的水分子，从而促进抗原与抗体相互吸引而结合。疏水作用力对于抗原抗体复合物的形成最重要，提供的作用力最大。

抗原分子组成的成分和次序的完整性是维持抗原表位空间构象的基础。以具有四级结构的蛋白类抗原举例，每一个抗原表位所包含的5～7个氨基酸的定位在蛋白质的一级结构中必须保持完整，这样可以使这些氨基酸在蛋白分子空间构象中所处的各自位置共同形成特定的空间构象；此外，要有相关的内环境以保持肽链局部的二级结构，在此基础上进一步形成稳定的三级结构即功能域，当两个或多个独立功能域相互之间形成四级结构并保持稳定后，抗原分子的免疫原性和免疫反应性得以保持。需要说明的是，抗原分子中并非所有基团都同等重要，而重要基团也并非始终位于抗原表位附近。

影响抗原抗体结合反应的因素较多，包括抗原抗体结合的亲和力与亲合力、抗原和抗体本身因素、反应基质因素和实验环境因素等。

抗原抗体结合的亲和力（affinity）是指抗体的每一个Fab片段与单个抗原表位结合的能力。抗原抗体结合反应的平衡常数K可反映出亲和力的大小，K值越大，抗体的亲和力越高，反之亲和力越低。抗体分子的抗原结合部位与抗原表位之间构象互补，使得两者的化学基团之间能够充分接触，抗体与抗原才有可能以较多的非共价键而发生结合反应。如果抗体分子的抗原结合部位与抗原表位之间的构象不能完全互补，形成的非共价键较少，造成两者分子之间的亲和力较低甚至不能结合。

抗原分子上所有抗原表位与抗体形成的总结合能力称为亲合力（avidity）。亲合力与亲和力、抗体的结合价、抗原的有效抗原表位数目呈正相关。

抗原的理化特性、表位数目和种类等均可影响抗原抗体结合反应。例如，红细胞或细菌等颗粒性抗原与相应抗体结合，当两者的数量和比例均适量时，可以形成较大的抗原抗体复合物，从而出现凝集现象；可溶性抗原与相应抗体结合可出现沉淀现象；与此相反，单价抗原与相应抗体结合则不出现凝集或沉淀现象。

抗体的来源、特异性、亲和力和数量以及与抗原分子的比例等均可影响抗原抗体结合反应。例如，鼠和羊等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物，而马和人的免疫血清等价带较窄，抗原或抗体过量都易形成钩状效应而导致生成可溶性复合物；此外，多克隆抗体较单克隆抗体的特异性差，容易发生交叉反应；单克隆抗体只针对一个表位，一般不适用于沉淀反应和凝集试验。

抗原抗体比例对抗原抗体结合反应所生成复合物的性质具有较大的影响。沉淀反应中，只有抗原抗体比例合适时才能形成肉眼可见的沉淀，反之，不能形成有效的沉淀或凝集，因为此时仅产生相对较小的抗原抗体复合物，即为可溶性免疫复合物。以凝集反应为例，若向加入固定量抗体的一组试管中再依次加入递增浓度的相应可溶性抗原，此时可发现两种分子只有在某些比例范围方能形成有效的凝集物。在此范围内，抗原抗体结合最为充分，凝集物形成较快而且数量较多。上述现象也被称为钩状效应（hook effect）。

钩状效应的特点表现为，在接近适宜比例的附近，抗体过剩时称为前带（prezone），抗原过剩时称为后带（postzone）。Marrack提出的网格理论（lattice theory）可以合理解释抗原-抗体反应比例性的机制。因为天然抗原大多是多价的，抗体大多为两价，当抗原与抗体在等价带结合时，抗体分子的两个Fab段分别与两个抗原表位结合，相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体，形成肉眼可见的沉淀物，基本不存在游离的抗原或抗体。当抗原或抗体过剩时，由于过剩方的结合价未被充分使用，故只能形成较小的网格复合物，并存在有较多游离的抗原（表位）或抗体。使用单克隆抗体时，如抗原分子中仅含有单一的该类表位，则无法形成有效的网格复合物。具体实验过程中要适当稀释抗原或抗体，以调整两者的浓度和比例，使其出现最有效的复合物，避免假阴性的发生。

反应基质通常指免疫测定反应液中干扰抗原和抗体反应的物质，其本质是待测物以外的非特异性因素，主要包括但不限于蛋白、电解质、补体系统成分、抗免疫球蛋白抗体（例如类风湿因子和人抗动物的同种型抗体）、药物或其他可能影响标本中待测物和反应体系的物质。反应基质与采用何种测定模式和测定技术以及抗原和抗体本身的特性等方面有较大关系，因此，不同免疫测定的具体影响因素和方式也有所不同。通过良好的实验设计，可减少反应基质因素的影响。例如，尽量使用高亲和力抗体株或抗体片段、尽量使用纯度较高的抗体试剂、降低标本用量使其占测定总体积的比例尽量降低、在测定缓冲液中加入免疫球蛋白以减少非特异性吸附和结合、采用理想的孵育温度和较长的温育时间等。

此外，不同的样本种类对抗原和抗体的反应和检测有不同的影响，如含有较多纤维成分的分泌物其黏度较高，对抗原和抗体的结合造成明显的干扰。临床免疫学检测常见样本的比较如表1-1所示。

抗原抗体结合反应的正常进行需要适当的反应体系，如电解质、酸碱度和温度。此外，标记免疫学检测在临床上使用广泛，标记物的性质对抗原和抗体的结合有重要影响。

抗原和抗体通常为蛋白质分子，在中性或弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，一定浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷，导致抗原和抗体分别单独发生沉淀或凝集。适宜浓度的电解质也可以促进抗原抗体相互结合，出现肉眼可见的沉淀物或凝集块。因此，反应体系中常用0.85% NaCl或其他离子溶液作为稀释液以提供适当浓度的电解质。当然，还必须考虑到缓冲液的离子强度，计算反应体系中总的晶体分子的浓度。

抗原与抗体反应一般在接近中性环境下较易发生。过高或过低的pH均可影响抗原、抗体的理化性质。此外，当反应液的pH接近抗原或抗体的等电点时，抗原或抗体所带正、负电荷相等由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应即假阳性反应。

抗原抗体结合反应最常用的温度为37℃和室温（25℃左右），其次是43℃和2～8℃。适当提高反应的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的形成。在一定温度范围内，温度越高，形成可见反应的速度越快。但温度过高也会使抗原或抗体变性失活，人为降低抗原抗体反应的效率，影响实验结果。某些特殊的抗原抗体反应对温度有特殊的要求，例如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上时反而解离。

临床常用的标记免疫学检测中，不同标记物种类如荧光素、酶和放射性核素等与抗原或抗体等通过共价键结合后，对抗原与抗体的结合性能也有明显的影响。

抗体的本质是球蛋白，大多数抗原亦为蛋白质。在通常的血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体，因此蛋白质分子不会相互凝集或沉淀。当抗原与抗体结合后，使表面电荷减少，水化层变薄甚至消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。此时，在一定浓度的电解质作用下，可以中和胶体粒子表面的电荷，使各疏水胶体进一步靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。

非均相免疫测定常涉及固相化的抗原抗体，固相表面抗原和抗体的结合反应通常具有与液相反应很大不同，至少包含以下特点：

液相中的抗原和抗体分子呈现布朗运动，当浓度较高时，两类分子相遇并发生特异性结合的概率较高，如果单纯从摩尔浓度的角度估计，理论上在分子数相同的情况下，液相中的抗原-抗体更容易接近或达到平衡。当然，还必须考虑到亲和常数和解离常数，因此，实际上最佳的抗原抗体比例是不同的。

固相免疫测定如双抗体夹心法ELISA中，固相表面的抗原或抗体分子处于相对静止状态，而待检抗体或抗原处于液相中，抗原抗体结合达到平衡所需要的时间较液相免疫测定长，并随液体所占体积与界面抗体所占体积比的增加而增加。当在酶标板上进行免疫测定时，界面反应动力学显示它对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强反应所需时间越短，结合越充分。通过旋转振荡可加速反应液中分子的运动速率，促进液相中抗原或抗体与固相表面抗体或抗原的结合。但这是一个平衡的双向过程，速度过快将导致两个结果，一是分子的势能过大反而不利于抗原和抗体分子形成复合物；二是已形成的复合物被其他分子碰撞而发生解离。

由于固相表面抗原与抗体的反应，发生在液体-固相的交界面，可能处于非共价键形成的有效引力距离内（10nm）。使用微球作为固相载体时，其反应表面区域较微孔要明显增大，因而处于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。因此，结合反应的效率也更高。这也是采用固相微球作为全自动化免疫测定分析方法固相载体的重要原因之一。

固相界面（包括细胞表面）抗原抗体复合物的解离速率较液相中的要低很多。正是这种极缓慢的解离速率，使得临床使用的固相免疫测定技术具有很好的反应性能，即使测定中需要多次和相对剧烈的洗涤步骤，也不至于影响已形成的抗原抗体复合物，使之保持结合状态。

固相化的抗原或抗体与液相中的抗原或抗体所展示的构象通常在某些区域存在差异。液相中的抗原或抗体分子处于天然构象状态，能确保抗原或抗体的天然免疫反应活性，抗原和抗体具有较高的利用效率。在固相免疫测定中，吸附于固相表面的抗原或抗体的构象发生变化，可能由于存在不同程度的非天然折叠、功能性结合部位在分子中的暴露程度发生明显改变如朝向固相等而发生改变，抗原或抗体的活性便会受到影响，所以抗原和抗体的利用效率通常低于液相免疫测定。

无论抗原抗体的反应介质是在液相中还是在固相表面，抗原抗体结合反应的基本特性都包括特异性、可逆性、比例性和阶段性等特点。

抗原抗体结合具有高度特异性，这种特异性是由抗原表位与抗体高变区所形成的独特型的互补结合所决定的。天然抗原表面通常含有多种抗原表位，可刺激机体产生多种特异性抗体。若两种不同的抗原分子的部分抗原表位相同或类似，则可与彼此具有一定相似性的抗体分子发生非特异的识别和结合，即交叉反应（cross reaction）。交叉反应可影响血清学诊断的准确性和重复性，采用单克隆抗体是克服交叉反应的有效方法之一。但是另一方面，有时也可利用交叉反应来进行诊断，例如变形杆菌OX19、OX2、OXk株与斑疹伤寒和恙虫病的病原体——立-克次体之间有相似的抗原表位，故可使用前者的提取物作为替代抗原，用于检测疑似斑疹伤寒病人的血清，如后者与试剂抗原发生阳性反应，出现可见的免疫沉淀或凝集，则可以达到诊断斑疹伤寒病的目的。

抗原与抗体结合的本质是两种分子表面的相应基团间发生识别并形成具有一定强度的非共价键结合，因而所形成的复合物不稳定，在一定的条件下可以解离为游离抗原与抗体，这种特性称为抗原抗体结合的可逆性。解离后的抗原或抗体仍然保持游离抗原和抗体原有的生物学活性。根据质量作用定律，抗原抗体复合物形成的速度与抗原和抗体的浓度成正比，浓度越高则反应速度越快，当反应达到平衡时，结合与解离的速度相等。由于某些待测抗原的浓度极低，需要检测方法有足够的灵敏度，此时可以采用的办法是提高试剂抗原或抗体的用量，并应尽量采用高亲和力的抗体。

抗原抗体复合物的解离度主要取决于两个方面：一是抗原抗体结合的亲和力，亲和力越高，解离度越低；二是抗原抗体结合反应的环境因素，如温度、酸碱度和离子强度等。当pH改变并达到或接近蛋白质的等电点时，可破坏离子间的静电引力，使抗原抗体的结合力下降；增加离子强度可使静电引力消失，降低抗原抗体的结合力，促使其解离。此外，改变反应液的酸碱度可以很大程度影响氢键的形成，这对于抗原抗体复合物的稳定性也十分重要。

抗原与抗体反应分为两个阶段，第一阶段是抗原与抗体特异性结合阶段，其特点是反应快：根据反应体积和两种分子的浓度以及反应液的形状等不同，通常可在数秒钟至数分钟内完成，一般不发生肉眼可见反应；第二阶段为可见反应阶段，根据参加反应的抗原的理化性状的不同，可出现凝集和沉淀等现象。第二阶段所需时间较长，从几分钟或几小时不等，有时需要数天。