第2章 基于组织学技术方法的免疫分析技术

2.1 免疫组织（细胞）化学技术

免疫组织（细胞）化学技术（Immunohistochemistry或Immunocytochemistry），是基于抗原抗体特异性结合反应及组织（细胞）化学的呈色反应原理，将显色剂（如酶、荧光素、同位素、金属离子等）标记的特异性抗体结合到组织或细胞的特定抗原上，从而对待测抗原进行定性、定位及定量测定的一项技术。因这种方法可对各种抗原物质（如蛋白质、多肽、激素等）进行组织或细胞原位的分布、表达丰度及细胞和亚细胞定位分析，因此在生物、医药等众多领域得到广泛使用。

根据标记物的不同，免疫组织（细胞）化学技术可分为免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织化学技术、亲和免疫细胞组织化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金（银）细胞组织化学技术、免疫电镜技术等。根据染色步骤不同，可以分为直接法和间接法。不同的免疫细胞组织化学技术，各自具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗体的制备、组织材料的处理、免疫染色、对照实验、显微镜观察等步骤。

免疫组织（细胞）化学技术适用于组织样本（如用组织样本制作的冰冻或石蜡切片）、单层生长的细胞（如细胞爬片）、悬浮细胞（如细胞离心涂片）等多种待检样品的分析。其中组织样本主要来源于活体组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本及尸体解剖标本等。为充分保存组织的抗原性，标本离体后，应立即进行固定、包埋处理（用固定液如10%中性福尔马林溶液、4%多聚甲醛缓冲液等固定，然后进行脱水、浸蜡、包埋）或速冻后进行冰冻切片，如暂不进行制片，也可储于液氮或-70 ℃保存。

下面将以测定小鼠脾脏中T淋巴细胞表面CD4分子为例，详细介绍冰冻组织切片的免疫组织化学染色流程。

1．实验仪器、耗材及试剂

①液氮。

②异戊烷。

③蒸馏水。

④OCT组织包埋剂。

⑤组织固定液：4%多聚甲醛或10%中性福尔马林溶液。

⑥1×PBS（pH 7.2～7.4）。

⑦封闭液：2%～10% BSA/PBS溶液（或者正常小鼠血清）。

⑧大鼠抗小鼠CD4分子单克隆抗体。

⑨辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠二抗。

⑩苏木素。

⑪梯度乙醇（50%～100%）。

⑫二甲苯。

⑬缓冲甘油。

⑭中性树脂。

⑮光学显微镜。

⑯冰冻切片机。

⑰载玻片、盖玻片。

2．实验步骤

（1）动物脏器的取材

实验小鼠脱颈处死，打开腹腔，快速取出脾脏，以1×PBS冲洗干净，用干净滤纸吸干脏器表面水分。用锋利刀片将组织修切成合适大小，使用OCT组织包埋剂将组织固定于组织托架上，放入液氮预冷的异戊烷中速冻组织，然后转入-20 ℃冰冻切片机内，准备切片。

（2）冰冻切片的制备

速冻的组织固定于冰冻切片机载物台上，先修整出合适的组织切面，然后换用锋利刀片进行切片，一般组织切面的厚度为4～6μm。用室温的载玻片迅速覆盖于切好的切面上，组织切面便粘贴于载玻片上。贴好的切片置于-20 ℃冰箱内保存备用。

（3）冰冻切片免疫组织化学实验步骤

①切片从-20 ℃冰箱取出，于室温下稍稍放置，以晾干水气。

②使用组织固定液于室温下固定15min。

③1×PBS冲洗，5min×3次。

④3% H2O2/PBS室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性。

⑤1×PBS冲洗，5min×3次。

⑥封闭液封闭，室温孵育30min。

⑦倾去封闭液，勿洗，滴加用封闭液以适当比例稀释的一抗（需预实验摸索，通常终浓度为1～5μg/mL），放置于湿盒中，4 ℃过夜。

⑧1×PBS冲洗，5min×3次。

⑨滴加用1×PBS以适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记二抗（需预实验摸索，通常终浓度为1～5μg/mL），放置于湿盒中，室温孵育1～2h。

⑩1×PBS冲洗，5min×3次。

⑪滴加显色剂（0.5mg/mL DAB, 1×PBS, 0.03% H2O2），光镜下掌握显色时间。自来水充分冲洗，以中止显色反应。

⑫苏木素复染30～60s。

⑬梯度乙醇脱水（50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% Ⅰ, 95% Ⅱ, 100%Ⅰ, 100% Ⅱ）。

⑭透明：在两份二甲苯溶液中分别浸泡15min。

⑮中性树脂封片。

⑯正置显微镜下观察染色结果。

知识窗

免疫组织（细胞）化学染色在临床疾病诊断中的应用实例

本节介绍了免疫组织化学染色的基本原理和步骤，但在实际的科研或临床应用中，往往需要同时对2个或2个以上的待测蛋白进行组织或细胞水平定位研究。林蓁等就采用了免疫组织化学双标技术帮助判断肿瘤组织侵犯（见参考文献[3]）。以DAB和快红（Fast Red, FR）作为呈色剂的EnVision法免疫组织化学双标技术标记肿瘤组织，肿瘤组织中肿瘤细胞被标记成棕色（DAB显色），血管淋巴管内皮与神经纤维被标记成玫瑰红色（FR显色），从而帮助医生或研究者观察、判断肿瘤组织中肿瘤细胞与血管、淋巴管及神经组织之间的相互关系（如图2-1所示）。