第八章　内分泌及血管活性物质与肾脏

第一节　促红细胞生成素

一、历史回顾

促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）的发现始于19世纪中叶。当时法国医生Jourdanet注意到，居住在海拔较高地区的人血液中红细胞含量较高，并认为此现象与高海拔区稀薄的空气相关，而较高的红细胞浓度可能有利于提高当地人的生活质量。Carnot与Deflandre随后初次假设或许人体中存在某种体液因子可调控红细胞的生成。此后人们用了半个世纪的时间来寻找这种物质。20世纪50年代前后，Reissmann[1]建造了一种异体共生的连体大鼠模型，大鼠间通过皮肤和肌肉连接，其中一只大鼠呼吸低氧含量的空气而另一只呼吸正常氧含量的空气。结果，连体的两只大鼠均观察到网织红细胞计数的增多与骨髓中红系造血的加强。由此更加确定了促红细胞生长的体液因子的存在。1953年，Erslev[2]将贫血兔子的血浆注射给正常兔子，发现这种血浆可以刺激不贫血兔子的红细胞增多，网织红细胞在短时间内大量增生，从而证明促红细胞生长的体液因子确实存在于血浆中，他将这种因子命名为EPO。而后的30多年中，有关EPO的研究取得了极大的进展。1977年EPO从无肾脏病的再生障碍性贫血患者的尿液中被成功提纯[3]；1985年EPO的基因序列被克隆及定位[4,5]；1989年美国食品及药物管理局（FDA）批准重组人促红细胞生成素（recombinant human EPO，rhEPO）作为EPO外源替代治疗上市，用于终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）患者贫血的治疗，从此结束了ESRD患者必须依赖输血的历史。

二、EPO的结构与生化特征

人类EPO基因位于染色体7q21-q22，编码序列位于第9.5kb到14kb（5’端）[6]，负调节单元位于第0.4kb到6kb序列[7]。EPO属于1型细胞因子家族[8]，是一个分子量为34kD的酸性糖蛋白。EPO基因为193个氨基酸的前多肽，在加工过程中切除N端的27个氨基酸变为166个氨基酸的功能蛋白质。rHuEPO缺失末端第166个精氨酸，是具有165个氨基酸的蛋白质[9]。EPO包含3个N端连接的和1个C端连接的糖链，每条侧链均有2～4个分支，多数分支的末端带有负电荷的唾液酸，后者的存在大大降低了EPO的降解速度[10]。糖链的生理作用较复杂，其在体外并不影响EPO的活性，但对于维持EPO的体内活性是必需的[11]。糖链上唾液酸残基的数目决定了EPO的半衰期，唾液酸残基含量越高，EPO在循环中半衰期越长，即使与受体的亲和力有所下降，但仍然对红系生成的刺激有更显著的作用[12]。另外，糖链在EPO的合成与分泌中可能也有一定的作用。

三、EPO的产生部位

人在胎儿时期的EPO主要由肝脏产生，而在出生后，肾脏便成为产生EPO的主要器官[13]。1957年，Jacobson等发现切除动物的其他器官后建立失血模型，对EPO的产生基本没有影响；而切除肾脏后的大鼠及兔子，失血后EPO均不升高，从而得出肾脏产生EPO的间接证据[14]。

Lacombe[15]与Koury[16]随后的研究提示肾脏产生EPO的部位是小管周围的间质细胞。进一步实验表明，EPO是由肾脏皮质和外髓部小管周围的成纤维细胞产生的[17]。1993年Bachmann等使用双标记技术证明了这一点[18]。研究者使用地高辛标记的cDNA探针定位EPO mRNA的产生部位，发现表达mRNA的部位不在小管上皮或管周的毛细血管，而是在小管与血管之间的空隙里。然后在同一切片上进行双染色，即对EPO mRNA进行染色的同时，对成纤维细胞表面的5’-核苷酸酶进行染色。结果发现，表达EPO mRNA的大多数细胞都表达5’-核苷酸酶，从而证明肾脏成纤维细胞是EPO的主要产生细胞。同年，Maxwell通过转基因小鼠同样证明了肾脏皮质内的成纤维细胞是EPO的产生部位[13]。但是，肾脏并不是唯一产生EPO的器官，肝脏[19]、脑[20]、视网膜及成骨细胞[21]等也可产生EPO，缺氧可上调这些器官中EPO mRNA的表达。

四、EPO的调节

肾脏产生EPO受肾脏皮质及外髓部组织含氧量的调节，肾脏局部的独特结构使其将缺氧和血容量状态联系起来：①在外髓和髓质内带，血管相对较少；②与逆流倍增系统类似，氧从肾小球前通过短路直接进入静脉系统，导致皮质组织氧分压低于静脉氧分压[22]。由于这些结构特点，当相应部位氧耗量变大时，容易出现组织缺氧。

产生EPO的肾脏成纤维细胞具备特异性的对缺氧敏感的调节机制，是一种能被缺氧诱导的转录因子，被称为缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）。HIF是由α亚基和β亚基构成的异源二聚体。HIF-β在细胞中的表达不受氧含量的影响[23,24]。HIF-α（包括1α，2α及3α）虽持续合成，但在氧气及亚铁离子存在时迅速经泛素-蛋白酶途径被降解[25]。在缺氧状态下，HIF-α降解速度减慢，造成其在细胞内积聚，并由胞质进入胞核，与HIF-β形成二聚体，通过HIF-α C末端的转录激活区域诱导辅激活蛋白p300/CBP招募入核，与之形成DNA结合复合体，并结合于缺氧反应元件而促进低氧反应基因如EPO的转录[26]（图1-8-1-1）。肾脏中的HIF-2主要调控EPO的生成[27]，其次为肝脏中的HIF-2[28]。有氧状态下HIF-α的降解依赖脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）对其脯氨酸残基的羟化，羟化后的HIF-α与von Hippel-Lindau（VHL）亲和力增加[29]，而后经泛素-蛋白酶途径降解，这样就阻止了EPO进一步转录，防止出现过高的血细胞比容。

五、EPO受体及受体后信号途径

EPO受体（EPO-receptor，EPO-R）是一个分子量为55kD的蛋白质，属于细胞因子受体超家族[30]，分为细胞外、跨膜和细胞内功能区，主要表达于红系集落形成单位（colony-forming units erythroid，CFU-E）阶段，并随着红细胞的成熟而数量递减，网织红细胞和成熟红细胞表面则没有受体存在[31]。

EPO与受体结合后，EPO-R发生同种二聚体反应，改变受体结构，与受体相连的JAK2自身磷酸化而被激活[32]。活化的JAK2将EPO-R胞质近膜部分的8个酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基可结合胞质内含SH2功能区的信号传导分子[33]，行使EPO促进细胞增殖和分化的功能。

EPO生物学效应的发挥有赖于其与EPO-R结合后产生的多种信号传导通路，包括JAK/STAT、JNK/p38 MAPK、RAS/MAPK、JAK/NF-κB等途径[34,35]。其中研究较透彻的是JAK/STAT途径[36]：在JAK2作用下，STAT5氨基酸残基磷酸化并形成二聚体，从胞质转移到胞核内，通过刺激Bcl-2和Bcl-xL抗凋亡基因转录而发挥抗凋亡作用[37]。此外，诸多研究表明EPO尚存在其他抗凋亡机制，从而证实是EPO强大的抗凋亡作用使红系祖细胞得以存活并最终向成熟红细胞分化[38,39]。

六、EPO的作用

从EPO的名称可得知其主要作用使促进红细胞增生，作用机制如前所述。过去人们普遍认为红系祖细胞是EPO唯一的靶细胞，但是近年来越来越多的研究显示EPO-R同样存在于神经细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞等部位，发挥着多样性的生物学效应。

肾脏分泌的EPO经血液循环作用于骨髓的红系祖细胞，因此EPO是一种内分泌激素。在大脑，缺氧刺激脑细胞产生EPO后直接作用于脑内的其他细胞，此时EPO又是旁分泌激素。另外一些脑细胞产生EPO后供其自身使用，使之表现出自分泌激素的特性。脑缺血缺氧时，局部产生的HIF-1启动包括EPO在内的一系列基因转录。脑细胞自身产生的EPO在某些糖链的末端缺失唾液酸，分子量更小，但作用却更强[40]。这些局部产生的EPO通过JAK及NF-κB等途径的抗凋亡作用对神经元起到保护[20]，增强NO的扩血管效应，并通过与血管内皮生长因子（VEGF）等细胞因子的共同作用，促进血管新生，建立侧支循环，以帮助缺血部位神经细胞存活。

近年来也观察到，EPO治疗可显著改善心肌梗死后的心功能，已证明这种心脏保护作用与细胞凋亡和坏死程度减轻有关，而与血细胞比容无关，说明EPO可直接保护缺血的心脏组织[41]。肾脏中的EPO-R提示EPO可能通过旁分泌或自分泌对肾脏起保护作用。在小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型中，EPO治疗能促进肾小管再生和功能恢复[42-44]。

七、EPO的检测方法及血浆水平

测定血浆或其他生物体液如尿液中EPO浓度对判断贫血或红细胞增多原因有重要价值。就临床应用而言，EPO的检测方式主要经历了3个阶段：体内生物活性测定、体外生物活性测定和免疫测定，体内外生物活性测定在临床上已较少使用。

目前最常用的检测EPO方法是免疫测定法。免疫测定法以抗原-抗体反应的特异性及亲和性为基础，具有快速、灵敏、简易的优点，不足之处是不能反映EPO的生物活性。早期采用放射免疫法，其灵敏度和特异性均很高，是人体内EPO浓度测定的标准方法，原理是将待测EPO与已知浓度的放射标记EPO竞争结合兔抗人EPO抗体[45]。由于此种方法需要已知浓度的放射性标记EPO，且分离结合与非结合EPO存在一定困难，因此临床使用受到限制。近年来，非放射免疫法如酶联免疫分析法（包括ELISA和EIA）、荧光免疫分析法和化学发光免疫分析法得到广大研究者青睐，特别是ELISA技术已经很大程度上取代了放射免疫法，这种技术使用两种分别针对不同EPO抗原决定簇的抗EPO抗体，其中一种抗体固定于微孔或微粒上，用于捕捉EPO，另一种抗体带有酶标，用于检测捕捉到的EPO[46,47]。

EPO的单位是根据其体内生物活性定义的，一般使用每升多少国际单位（U/L），并定义1国际单位EPO对红系祖细胞的刺激作用相当于5μmol氯化钴的作用[8]。正常血浆EPO的浓度约为10～30U/L，此水平的EPO足以刺激足够的红细胞产生以补充衰老的红细胞。失血和缺氧可导致血浆EPO浓度迅速升高100～1 000倍[48]。

原发性红细胞增多症是一种骨髓增生性疾病，其红系祖细胞逃逸EPO的控制自主增生，这些患者的血浆EPO一般低于正常参考值或在正常范围内[49]。而继发性红细胞增多症是由于EPO过度生成导致的红系增生。导致EPO过度生成的原因可以是机体对低动脉氧分压的生理反应，如高原地区空气稀薄、某些心脏和肺部疾病、氧与血红蛋白结合力升高等；也可以是自主产生EPO的肿瘤分泌过量EPO。继发性红细胞增多症患者血浆EPO水平往往升高，但是由于EPO半衰期的变化，其血浆水平可以在正常参考值范围内。

八、重组红细胞生成刺激剂简介

目前，用于治疗慢性贫血的基因药物包括rhEPO、EPO类似物和持续性红细胞生成受体激动剂（continuous erythropoiesis receptor activator，CERA），这些制剂被统称为红细胞生成刺激剂（erythropoiesis-stimulating agents，ESAs）。

rhEPO的生物学特性和氨基酸顺序与内源性EPO极其相似，只是比后者具有更多的糖链。根据糖链的不同，目前rhEPO有α、β、ω和δ四种，目前我国市场可用的有α和β两种制剂。这四种rhEPO的糖链数量及其与氨基酸核心的结合方式各有不同，表现出的理化性质也各有特点，但临床治疗肾性贫血的效果基本相似。

20世纪90年代末，EPO类似物Darbepoetin-α问世，此药具有2条额外与N端相连的糖链，从而使唾液酸残基的数量达到22个之多[10]。这种高度糖基化的结构使之与EPO-R亲和力降低，但其却在体内具有较高的代谢稳定性，半衰期可达rhEPO的3倍左右，生物学效应大大提高[50,51]。

ESA的新一代制剂CERA由一个蛋白质核心、一个甲基聚乙烯乙二醇多聚体和琥珀酸亚胺丁烷酸连接组成。它与受体的亲和力低而解离速度快，从而使其可以重复结合，延长了体内的半衰期。CERA不能进入细胞内，推测其不断与EPO-R结合、刺激和解离，信号被传导至细胞内而产生生物学效应[52,53]。

（任玥鵆　郝传明）

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第二节　维生素D代谢及其相关激素

维生素D属于脂溶性维生素，是调节机体钙、磷平衡及骨形成的重要激素。维生素D通过促进钙、磷的肠道吸收以及肾脏重吸收来调节钙、磷的平衡。维生素D缺乏会导致循环中甲状旁腺激素（parathyroid，PTH）水平升高，进而对骨代谢带来一系列不利影响。肾脏是产生活性维生素D的主要场所，也是影响其代谢的重要器官，肾脏疾病时会出现各种与维生素D代谢异常相关的病理生理改变，这些改变又对肾脏及其他脏器产生各种影响。

一、1,25-二羟维生素D的生成及其代谢

天然的维生素D在体内有两种形式，一种为植物来源的麦角骨化醇（维生素D₂），另一种是动物来源的胆骨化醇（维生素D₃），这两种维生素D的生物学作用基本一样，代谢非常类似。除饮食来源外，维生素D₃也可在皮肤合成。在紫外线作用下，皮肤的7-脱氢胆固醇形成维生素D₃前体，然后转化为维生素D₃，并释放入血液循环中，与维生素D结合蛋白（vitamin D-binding protein,DBP）按1∶1的比例相结合，运输并储存于肝脏。DBP是由肝脏合成的一种糖蛋白，它在血浆中的水平不受维生素D调节。

正常情况下，维生素D在体内代谢过程中涉及两个重要的羟化步骤。首先，在肝脏经25羟化酶的作用，形成25-羟维生素D[25(OH)D₃]。25羟化酶存在于肝细胞线粒体内，是一种细胞色素P-450加单氧酶，它催化的羟化反应是底物依赖的，不受肾脏疾病的影响。因此，检测25-羟维生素D可以很好地反映维生素D的摄入情况。25-羟维生素D在肝脏合成后进入血液中，除极少部分以非结合状态存在外，绝大部分25-羟维生素D是与DBP和白蛋白相结合的。另一羟化过程在肾脏完成。肾脏是产生1-α羟化酶的重要场所，1-α羟化酶主要分布于肾脏近端小管上皮细胞线粒体内膜，该酶也属于细胞色素P-450加单氧酶。25-羟维生素D在1-α羟化酶的作用下生成1,25-二羟维生素D[1,25(OH)₂D₃]，即骨化三醇，它是最具有生物活性的维生素D。近年来发现除了肾脏可以产生1-α羟化酶外，胎盘、角质细胞、单核/巨噬细胞系及骨细胞等也有1-α羟化酶活性，提示一些组织局部可调节1,25-二羟维生素D的生成，这种作用可能是对肾脏合成不足时的一种代偿。此外，肾脏内还有24羟化酶，可将25-羟维生素D转变为活性很低的24,25-二羟维生素D[24,25(OH)₂D₃]。

1,25-二羟维生素D的灭活主要通过在靶细胞内其侧链的氧化或羟化，其中以C24氧化灭活的反应最重要，生成多种代谢产物在肝脏与葡萄糖醛酸结合后随胆汁排出，在小肠内有一部分被吸收入血，形成维生素D₃的肝肠循环。

维生素D的多数生物学作用是通过调控基因表达来实现的，维生素D和维生素D受体（VDR）相结合，配体-受体复合物转入细胞核，作用于不同基因的反应元件。目前发现，VDR在体内广泛存在，因此，1,25-二羟维生素D可以作用于多种靶组织，发挥不同的生物学效应。

二、1,25-二羟维生素D生成的调控因素

当肾功能受损、有效肾单位减少时，肾脏1-α羟化酶产生减少导致1,25-二羟维生素D水平降低。低血钙可促进肾脏1-α羟化酶的活性，从而使25-羟维生素D转化为1,25-二羟维生素D；高血钙则使肾脏24羟化酶的活性增强，24,25-二羟维生素D产生增多，1,25-二羟维生素D产生减少。此外，低磷血症、增高的甲状旁腺激素（PTH）均可刺激肾脏1-α羟化酶活性，而高血磷、PTH下降可减弱1-α羟化酶活性，从而影响1,25-二羟维生素D的合成。

近来研究发现，由骨细胞、成骨细胞及破骨细胞分泌入循环中成纤维细胞生长因子23（ fibroblast growth factor23，FGF23）也参与了磷及1,25-二羟维生素D的调控。FGF23是一种32kDa的肽类物质，高磷血症及血中1,25-二羟维生素D水平升高时分泌增加。FGF23通过其特异性受体并经由跨膜蛋白-Klotho共同组成的复合物发挥作用，后者是FGF23发挥活性作用的先决条件。FGF23可作用于钠-磷协同转运子（NPT），抑制近曲小管对磷的吸收（拮抗该位点维生素D的作用），同时抑制肾脏1-α羟化酶，从而减少1,25-二羟维生素D的合成，进而抑制消化道和肾脏对磷的吸收。降低的血清磷能下调骨骼细胞FGF23的生成，从而完成反馈调节[1]。

1,25-二羟维生素D对其本身的生成具有负反馈调节作用。当血中1,25-二羟维生素D水平升高时，可抑制肾脏1-α羟化酶活性，增强24羟化酶活性，使得24,25-二羟维生素D产生增加。

由于血钙、磷、PTH、FGF23等均可独立影响肾脏1-α羟化酶的活性，因此，健康人血浆25-羟维生素D与1,25-二羟维生素D水平一般不相关，两者测定值也不平行。如在维生素D缺乏时，低钙血症、低磷血症、增高的PTH水平可单独或共同通过增强肾脏1-α羟化酶的活性，促进1,25-二羟维生素D的生成。因此，尽管25-羟维生素D的水平降低，1,25-二羟维生素D仍保持正常甚至升高水平。因此，除非存在严重的维生素D缺乏，25-羟维生素D很少影响1,25-二羟维生素D的生成。但是慢性肾脏病（CKD）患者血浆25-羟维生素D与1,25-二羟维生素D是中度相关的，这可能与肾脏病进展过程中调控肾脏1-α羟化酶活性的机制破坏有关。

三、1,25-二羟维生素D对矿物质代谢的调节作用

循环中的1,25-二羟维生素D经由细胞的基因机制及非基因机制来调控矿物质代谢。

每日由肠道进入细胞外液的钙量约为200mg，它主要靠增加维生素D依赖的肠道主动吸收来完成。在饮食钙摄入量下降时，维生素D依赖的这一过程尤其重要。1,25-二羟维生素D可以通过增加肠道上皮细胞电压依赖的V5型及V6型瞬时受体电位钙通道（transient receptor potential vanilloid channel, TRPV5 & TRPV6）的活性促进钙的吸收[2]。1,25-二羟维生素D还能上调维生素D依赖的钙结合蛋白（小肠中为9kD，肾脏中为28kD）以及基底侧钙-ATP酶促进钙的细胞转运。

维生素D对肠道磷吸收的影响经由钠磷共转运系统实现，这一过程是能量依赖的，由Na+-K+-ATP酶供能，经钠磷共转运系统，使磷穿过上皮细胞刷状缘膜而促进肠道磷的吸收。这部分磷虽只占肠道磷吸收的一小部分，但与因甲状旁腺功能亢进而接受维生素D治疗的CKD患者高磷血症恶化密切相关。1,25-二羟维生素D对肾脏磷排泄的调节作用尚未完全阐明，应用外源性活性维生素D或其拟似物可能通过其对血钙和PTH水平的影响而导致尿磷排泄减少[3]。

1,25-二羟维生素D直接抑制PTH合成。早期同位素标记的1,25-二羟维生素D研究发现其定位于甲状旁腺，这一腺体表达维生素D受体（VDR），而1,25-二羟维生素D可以减少PTH前体蛋白的mRNA合成[4]。其后，在多种动物研究及人类研究中均发现1,25-二羟维生素D在调控PTH分泌中发挥重要作用。低钙、高磷刺激PTH合成，而1,25-二羟维生素D则具有相反的作用[5]。给予维持性血液透析患者口服1,25-二羟维生素D，而非维生素D前体能抑制PTH生成[6]。除此之外，1,25-二羟维生素D对甲状旁腺的增生也有抑制作用，在维生素D基因敲除的动物模型中，即使血钙水平正常，甲状旁腺组织仍进行性增生。外源性给予1,25-二羟维生素D后，增生的甲状旁腺组织得到了抑制，这一作用甚至不依赖于VDR[7]。

1,25-二羟维生素D对骨矿化有重要作用。然而，在维生素D缺乏的动物模型中，维生素D系统对于骨骼的直接效应很难与继发于低钙血症、高磷血症的作用相鉴别。在过去的数十年时间中，得益于基因敲除动物模型的应用，维生素D对于骨矿化的生理作用得到了更好地阐明。1-α羟化酶或/和VDR基因敲除小鼠将出现骨矿化障碍。在上述转基因小鼠中，纠正血钙水平可以使骨矿化恢复正常[8]。而且，在1-α羟化酶基因敲除小鼠中，外源性补充1,25-二羟维生素D并纠正低钙水平才能完全纠正骨矿化异常。在骨重构研究中同样发现1,25-二羟维生素D/VDR系统发挥了重要作用。持续低钙血症将导致继发性甲状旁腺功能亢进，PTH合成增加，继而增加了成骨细胞的活性以及骨的合成。在骨矿化过程中，维生素D与PTH具有协同效应。当通过增加饮食摄入或治疗甲状旁腺功能亢进而纠正低钙水平后，成骨细胞数量、骨矿化活性及骨容量仍处于较低水平。可见，1,25-二羟维生素D/VDR系统对于骨形成是必需的，它进一步补充了PTH的作用[7,8]。

四、维生素D与慢性肾脏病

维生素D受体VDR几乎表达于所有细胞中，因此，维生素D对多种组织的不同细胞都具有调节作用。近年来，维生素D调节细胞的增殖及分化，调控固有免疫功能，调节胰岛素敏感性以及骨骼及心血管系统健康等的非经典作用引起了越来越多的关注。在普通人群的流行病学研究中发现，维生素D不足及缺乏与肿瘤风险、高血压、纤维肌瘤综合征、风湿性疾病、糖尿病及抑郁症的发病有关[9]。

在肾功能受损时，由于肾脏1-α羟化作用损害，25-羟维生素D向1,25-二羟维生素D的转化减少，循环中1,25-二羟维生素D水平降低。1,25-二羟维生素D水平的降低则减少了对PTH基因转录的抑制以及减少肠道钙的吸收，从而上调PTH的合成。此外，由于VDR表达的减少使靶细胞对1,25-二羟维生素D的作用产生抵抗。这种绝对和相对的1,25-二羟维生素D的不足是CKD患者发生继发性甲状旁腺功能亢进的重要原因之一。传统意义上慢性肾脏病-矿物质代谢异常（CKD-MBD）的自然病程由三个连续过程组成：①当肾小球滤过率（GFR）小于60ml/min时，1,25-二羟维生素D水平下降；②当GFR低于40ml/min时，发生继发性甲状旁腺功能亢进；③当GFR低于30ml/min时，血清磷水平升高。然而，近来研究发现，血清磷水平早在CKD 2～4期就可出现升高，甚至早于1,25-二羟维生素D不足、PTH水平升高及继发性甲状旁腺功能亢进的发生。因此，有学者重新划分CKD-MBD的病程：第一阶段为GFR大于59.1ml/min，表现为伴随FGF23升高及1,25-二羟维生素D水平下降的轻度高磷血症；当GFR小于59.1ml/min进入第二阶段，此时FGF23急剧增高，磷排泄分数（FEPi）升高，1,25-二羟维生素D水平进一步降低，血清磷水平进行性升高，继而发生继发性甲状旁腺功能亢进症[10]。

除此之外，肾病综合征时由于维生素D结合蛋白从尿中丢失，血浆25-羟维生素D水平降低（游离的维生素D水平通常正常），血浆25-羟维生素D水平与尿蛋白量呈负相关[11]。肾小管酸中毒时，骨离子成分发生变化，磷灰石、钠、钾盐含量减少，抑制与成骨相关的基质基因表达，破骨细胞活性增加，并能通过抑制肾脏1-α羟化酶，减少1,25-二羟维生素D的生成，进而减少钙的吸收，改变了血中离子钙、PTH和1,25-二羟维生素D的稳态关系，使骨溶解加剧[12]。

不同于普通人群，肾功能损伤的CKD患者血1,25-二羟维生素D水平与25-羟维生素D水平中度相关。研究显示，在中度肾功能损害的CKD患者中给予低钙饮食后，血清1,25-二羟维生素D的水平会提高[13]。骨化三醇[1,25(OH)₂D₃]，其前体药物-阿法骨化二醇[1a(OH)D₃]，维生素D拟似物，包括帕里骨化醇、度骨化醇及沙骨化醇都可以用于治疗CKD5期患者继发的甲状旁腺功能亢进症。最佳的给药种类及给药途径目前尚无定论。而控制25-羟维生素D在何种水平也没有共识。K/DOQI指南建议，在CKD 3、4期的患者如果血清25-羟维生素D水平低于30ng/ml，需要补充维生素D₂，如果血清PTH水平高于靶目标值（CKD3期：35～70pg/ml；CKD4期：70～110pg/ml），并且血磷小于4.6mg/dl（1.99mmol/L）、血钙小于9.5mg/dl（2.37mmol/L），则可使用活性维生素D[14,15]。对于蛋白尿的CKD患者，尤其是肾病综合征及糖尿病大量蛋白尿的患者，由于持续性DBP以及维生素D从尿液中丢失，血25-羟维生素D水平通常显著下降，补充维生素D可以改善维生素D营养状态。在一些动物研究中，维生素D活化后还能抑制肾素产生[16,17]，在一项大型回顾性研究中还发现，在已经应用了血管紧张素受体抑制剂的糖尿病CKD患者中，帕里骨化醇能进一步减少蛋白尿[18,19]。活性维生素D的使用代表了治疗继发性甲状旁腺功能亢进及肾性骨营养不良的一个里程碑，但这一治疗可能带来潜在高血钙、高血磷的副作用以及增加心血管钙化的危险。还需更长观察期、更多样本量、针对不同CKD病程的随机对照临床研究的结果以指导临床治疗。同时，活性维生素D减少蛋白尿等其他治疗裨益，同样需要设计规范的临床研究以得出结论。

（尤　莉　郝传明）

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第三节　肾素-血管紧张素系统

从1898年发现肾素后，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）已经被认识100多年了。最近几十年来，由于分子生物学的发展，对该系统的成分和作用出现了很多新的认识，该系统过度兴奋而产生的病理生理意义也受到广泛重视。

一、肾素-血管紧张素系统各成分的构成、分布及特征

（一）肾素-血管紧张素的传统认识和扩大认识

传统观念认为，肝脏是血管紧张素原的主要组织来源，肾脏是产生肾素的主要器官，血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）则主要来源于肺。肾素-血管紧张素系统始于肾素将血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ），Ang Ⅰ在ACE的作用下转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），AngⅡ通过与其受体相结合发挥其生物学效应。随着研究的进一步深入，人们发现组织纤溶酶原激活物（TPA）、紧张肽（tonin）、组织蛋白酶、胰蛋白酶等物质可直接将血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅱ。除了ACE之外，紧张肽、组织蛋白酶G、糜蛋白酶等也可将血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，而且非ACE途径产生的AngⅡ占心脏内AngⅡ总量的80%以上，占血管内AngⅡ总量的60%以上。

随着生物技术各个领域的发展，在RAS中发现了许多新的成员：血管紧张素转换酶2（ACE2），是ACE的第一个同源体，是RAS系统重要的负向调节酶；各种血管紧张素肽类，包括Ang Ⅲ[或Ang-(2-8)]，Ang Ⅳ[或Ang-(3-8)]，Ang-(1-7)，前血管紧张素-12；以及与肾素和前肾素高亲和力相结合的肾素/前肾素受体等。另外，RAS除了传统的内分泌作用之外，局部组织RAS还可独立通过旁分泌、自分泌以及可能的胞内分泌发挥作用。对RAS新成员及RAS作用方式的逐步深入形成了对RAS的扩大认识（图1-8-3-1）。

（二）RAS成员的构成，分布及特征

1.血管紧张素原

人类血管紧张素原基因是单拷贝基因，含有5个外显子和4个内含子，位于染色体1（1q42-q43）上，全长约13kb。翻译后形成含453个氨基酸，分子量约45～65kD的球形糖蛋白，再经过翻译后分裂出24或33个氨基酸的信号肽，最后形成成熟的循环血管紧张素原。结构上与蛋白酶抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族同源，在炎症状态下呈急性时相反应。

2.肾素和前肾素及其受体

（1）肾素的来源：

肾小球球旁细胞（juxtaglomerular cells，JGCs）是循环中肾素的最主要来源。通常认为是JGC由平滑肌细胞化生而来，因为成年的JGCs含有肌丝成分。但现在的研究发现平滑肌细胞是起源于肾素细胞，而不是肾素细胞起源于平滑肌细胞[1]。成血管细胞起源于肾后间充质细胞（metanephric mesenchymal cells，MC），而内皮细胞则起源于成血管细胞。并且血管平滑肌细胞和肾素前体细胞也来源于MCs。在个体发育过程中，这些肾素前体细胞可以分化成JGCs，也可以分化成动脉平滑肌细胞的亚型。此外，来源于肾素前体细胞的平滑肌细胞在特殊情况下也可以通过组织转化成为肾素细胞。

（2）肾素和前肾素及其受体：

肾素是一种糖基化的单链蛋白酶，它由细胞内合成的前肾素原（pre-prorenin）去掉信号肽（人的前肾素原为含有23个氨基酸的信号肽），成为肾素原（prorenin）。一部分肾素原直接释放到血液循环里，一部分再经过细胞内的加工，去掉若干氨基酸转变成为单链活性肾素，贮存在分泌颗粒内。在临床研究中发现，无论用ACE抑制剂（ACEI）还是血管紧张素受体拮抗剂（ARB）后，最后都会导致血浆中肾素水平升高，人们最初认为这是由于阻断RAS后肾素代偿分泌增多的结果。但是2002年Nghyen G等从人肾脏克隆出含350个氨基酸的细胞膜相关多肽，可与肾素和前肾素高亲和力相结合，可引发一系列的细胞间的信号通路，称为肾素/前肾素受体[2]，到现在为止共发现三种肾素/前肾素受体[2-5]。

（3）肾素分泌的调节：

肾脏对肾素的分泌和调节是一个非常复杂的过程[6-8]。在众多调节机制中，致密斑机制和肾小管氯离子浓度相耦联，与血浆肾素浓度作用相反（发生在髓袢升支粗段）。肾脏内肾素释放的改变有助于决定管球反馈的敏感性，结果可以调节启动肾血流的自身调节。

第二个机制是肾脏交感神经的调节机制，可以通过JGCs细胞上的β肾上腺素能受体刺激肾素分泌，该过程可能是通过cAMP介导。cAMP是决定肾素分泌速率的重要的第二信使。但是cGMP对肾素分泌的作用还存在一定争议，有人认为是刺激作用，也有人认为是抑制肾素分泌的。有学者发现cGMP可以通过抑制磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）的活性，抑制cAMP的降解，从而刺激肾素的分泌。有研究还发现，cGMP对膜电容的作用可以被阻断PKA而抑制，提示cAMP-PKA通路参与了cGMP介导的JGC细胞的肾素分泌作用[9]。

目前认为调节肾素分泌的三个主要细胞内第二信使是cAMP、cGMP和细胞内游离钙离子。前面两个第二信使我们在前文中已经提到，关于细胞内的游离钙离子，它的浓度升高可抑制肾素的释放。由于通常情况下钙离子能够促进胞吐作用，而对于肾素分泌的抑制则被称为“肾素分泌的钙反常现象”（calcium paradox of renin release）。目前对于这种肾素分泌的钙反常现象，机制还不是十分清楚。有研究发现，钙离子可抑制JGCs的腺苷酸环化酶（adenylate cyclases，AC）AC5和AC6，从而抑制了cAMP的产生。也就是说，在JGC细胞中，细胞内钙离子的浓度和cAMP的水平呈现相反的关系，钙离子浓度的降低可提高cAMP水平，而钙离子浓度的升高则会抑制cAMP水平[10,11]。NO在细胞内信号通路的角色则是：NO通过可溶性的鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）促使cGMP的产生，从而抑制了PDE3对cAMP的降解，导致cAMP产生增加，刺激肾素分泌[12,13]。总之，在肾素分泌过程中，cAMP信号途径被认为最关键、最直接的启动因子。

还有一个促进肾素释放的机制就是压力敏感机制，这个机制和交感神经的刺激以及一些激素的释放有关，比如缩宫素等，它能通过β肾上腺素能受体依赖机制而发挥作用[14]。

（4）肾素的生理作用：

研究发现肾素/前肾素受体在肾小球系膜细胞、肾皮质血管、肾脏远曲小管和集合管上皮细胞，以及冠状动脉的血管平滑肌细胞上有所分布。在肾小球系膜细胞、心脏和视网膜等多个脏器，肾素和前肾素均可与肾素受体结合，经受体依赖性及非受体依赖性两种方式发挥作用：①对血管紧张素原转化为Ang Ⅰ的作用明显加强；②在培养的系膜细胞中当肾素与其受体结合，即使在充足ACEI或ARB作用下，仍可导致FN及PAI-1表达增加，其作用的信号途径是MAPKs（ERK1/2），而肾素本身在此背景下并不经蛋白水解作用，称之为非水解性作用[15]；③肾素受体还可以和空泡质子三磷酸腺苷酶（vacuolar proton ATPase）相结合，不依赖RAS而独立发挥作用[16]。

肾素抑制剂对高血压引起的心、肾损伤具有保护作用。大量实验表明，肾素抑制剂在双肾切除、钠负荷及钠耗竭动物模型都有降压作用，且无论基础肾素水平和钠平衡状况如何均不影响降压作用。但在高肾素条件下降压作用更明显，钠耗竭可以增强降压效果。肾素抑制剂对肾脏的保护作用部分是由于不依赖于RAS而改善了肾脏的血流动力学和远曲小管的功能，对于靶器官的炎性反应、细胞增殖抑制是由于肾素抑制剂抑制了RAS的激活，从而降低了AngⅡ水平所致[17]。

3.血管紧张素转化酶（ACE）和血管紧张素转化酶2（ACE 2）

（1）ACE：

ACE是一种含锌的二肽酰羧肽酶，能使AngⅠ的组氨酸和亮氨酸末端断裂，形成八肽的AngⅡ。除此之外，ACE还能催化缓激肽的失活。体细胞的ACE几乎存在于所有组织，是含有1 306个氨基酸，分子量140～160kD的糖蛋白，含有两个活性部位。ACE不仅在组织中，而且在大多数体液中亦具有活性。在人体肾脏中，ACE主要分布在近端和远端肾小管，但分布量和分布部位可因疾病而改变[18]。

（2）ACE2：

2000年报道了一种新发现的与人类ACE相关的羧肽酶，称之为ACE2[19]。ACE2是由805个氨基酸组成的Ⅰ型膜结合糖蛋白，包括一个由17个氨基酸组成的N末端信号肽区，一个金属羧基多肽酶活化位点和一个跨膜区。其活化位点是一个氨基酸序列为HEXXH（第374～378位氨基酸残基）的锌结合区，类似于ACE活化位点，其氨基酸序列与ACE有42%同源性，对二者基因结构的对比分析发现ACE2基因所包含的18个外显子与ACE基因的前17个外显子的结构具有相当大的类似性[20,21]。

与ACE的普遍性分布不同，ACE2主要分布于心脏和肾脏的血管内皮细胞、冠状动脉血管平滑肌细胞、肾小管上皮细胞、肾内小动脉和睾丸，最近的研究表明ACE2也存在于心、肾、睾丸、中枢神经、淋巴细胞、消化器官等[22,23]。

在功能上，与ACE可以水解血管紧张素肽类羧基末端的二肽不同，ACE2作为一种专一的单羧基肽酶（锌依赖性金属蛋白酶），仅能水解一个氨基酸残基。在RAS中，ACE2能水解AngⅠ羧基末端的亮氨酸残基将其转换为Ang(1-9)，并进一步在ACE或其他肽酶水解下生成Ang(1-7)；或者直接水解AngⅠ的产物AngⅡ后，生成Ang(1-7)。研究证实ACE2水解AngⅡ时的催化活性较水解AngⅠ高400倍[24]，说明ACE2是AngⅡ水解的主要途径，且Ang(1-7)是其主要产物。ACE-2可通过多种途径与AngⅡ对抗，可通过直接对抗AngⅡ、刺激B2受体、刺激NO产生、兴奋AT2受体、或降解neurotensin，kentensin以及APJ受体等途径。ACE2水解AngⅠ和AngⅡ后，一方面减少了具有缩血管效应的血管紧张素肽类含量，提高了机体中舒血管物质的水平，另一方面生成Ang(1-7)发挥扩血管作用，因此ACE2水解血管紧张素家族成员最直接的结果就是舒张血管，引起血压下降，它作为ACE的一个反式调节方式，在心脏和肾脏血管的舒缩过程中发挥重要的平衡作用。

ACE2作为调节血压的重要影响因子与高血压和心血管疾病的发生发展密不可分。基于ACE2对RAS系统的负向调节作用，因此对心脏功能起着重要的调节作用。如Crackower等[25]研究发现，敲除ACE2基因的小鼠血浆及局部组织（如心脏与肾脏）AngⅡ水平升高，缺氧诱导基因上调以及严重的心脏功能受损。同时敲除小鼠ACE和ACE2基因则心脏功能没有变化。表明敲除ACE2基因后心脏AngⅡ增加是导致心脏功能异常的原因。研究还发现，心力衰竭的心脏中ACE2基因的表达和活性显著增加[26]。Burrell等[27]研究了小鼠心肌梗死后ACE2的基因表达。结果发现，小鼠梗死边缘与未梗死交界区和梗死后存活心肌中ACE2基因表达显著增加。表明梗死边缘心肌存在急性炎症或损伤修复反应时ACE2基因表达激活；以及由室壁张力增加或其他与心室重构有关的因子所诱导的慢性反应。其具体的激活过程和机制尚不清楚。

ACE2除了对RAS的调节作用外还可能有其他的重要功能。研究发现，肾脏中存在ACE2，虽无血管紧张素酶活性，但却在肾脏器官的形成发育中起一定作用[28]。Lely等[29]研究发现，正常情况下，ACE2在肾脏主要存在于肾小管和肾小球上皮细胞、血管平滑肌细胞和叶间动脉内皮细胞。ACE2参与肾脏局部RAS调节和糖尿病肾病的发展，ACE2与足突上皮细胞屏障功能有关，ACE2缺乏可导致蛋白尿形成和肾小球硬化。

4.血管紧张素肽类

（1）Ang Ⅲ[或Ang-(2-8)]：

在氨基肽酶A作用下形成的七肽的血管紧张素Ⅲ，亦称为血管紧张素-(2-8)，也是通过与AT1受体和AT2受体的结合发挥作用[30]。人们最初认为Ang Ⅲ在调节血管升压素释放方面起重要作用，但近来研究提示AngⅢ在对血压的影响、醛固酮的分泌和肾功能的影响方面与AngⅡ相同，但其代谢清除率是AngⅡ的五倍[31]。

（2）Ang Ⅳ[或Ang-(3-8)]：

Ang Ⅳ由Ang Ⅲ在氨基肽酶M的作用下形成。尽管Ang Ⅳ的部分作用由AT1受体介导，其绝大部分生物学作用是通过和胰岛素调节的氨基肽酶结合后实现的[32]。Ang Ⅳ对中枢神经系统的作用表现为增强学习和记忆能力，而且具有抗惊厥和对大脑缺血性损伤具有保护作用。除了中枢神经系统的作用外，Ang Ⅰ还在动脉粥样硬化形成方面起作用，主要是与其激活NF-κB，上调许多促炎症因子（如MCP-1，ICAM-1，IL-6和TNF-α），以及增强促血栓因子PAI-1的合成作用相关[33]。在肾脏，Ang Ⅳ在肾血流量调节和尿钠排泄方面起作用[32]。

（3）Ang(1-7)：

Ang(1-7)是由天冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、脯氨酸组成的7肽，在-20℃下保存较稳定。在体内生成Ang(1-7)的途径至少有3条：① 10肽的AngⅠ（天冬氨酸，精氨酸，缬氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，组氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，亮氨酸）被中性肽链内切酶（NEP）或脯氨酰肽链内切酶（PE）去掉3个氨基酸残基，形成7肽的Ang(1-7)；② 8肽的AngⅡ（天冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸）在ACE2、PE或脯氨酰羧肽酶（PCP）的作用下，去掉一个氨基酸残基，也可生成Ang(1-7)；③ AngⅠ在ACE2的作用下先生成无活性的Ang(1-9)，再由血管紧张素转化酶（ACE）或NEP分解生成Ang(1-7)。Ang(1-7)可被ACE降解为Ang(1-5)，迄今未发现其有生理活性。

Ang(1-7)对心血管系统有众多的有益作用。Ang(1-7)具有直接扩血管作用，并且具有明显的内皮依赖性。目前认为Ang(1-7)的扩血管效应至少部分是通过一氧化氮（NO）、前列腺素、内皮源性超极化因子等3种内皮依赖性介质起作用。去除血管内皮、加入一氧化氮合酶（NOS）抑制剂或环氧合酶抑制剂吲哚美辛均能抑制Ang(1-7)的扩血管效应，提示Ang(1-7)的扩血管效应有内皮、NO、前列腺素的参与，但在不同种属或组织中，三者所起的作用有一定的差异。

Ang(1-7)还在维持体内纤溶系统平衡和防止血栓形成方面发挥重要作用。一项有关高血压的随机对照研究发现，AT1拮抗剂可显著降低循环中PAI-1水平[34]。因ACEI和AT1拮抗剂可使血中Ang(1-7)水平升高5～25倍，半衰期延长至60秒以上，两者的抗血栓作用可被A2779所阻断，所以推断其抗血栓作用是通过Ang(1-7)实现的。此外，Ang(1-7)还可通过肾脏调节水、电解质代谢平衡，且Ang(1-7)是通过A-779敏感的受体发挥作用的[35]。

（4）Ang(2-10)：

除了Ang Ⅱ和上述的C端分裂产物，血管紧张素-(1-10)通过N末端氨基酸分裂也能产生一些具有潜在生物学活性的肽类。其中由氨基肽酶A产生的Ang-(2-10)，能够调节啮齿类动物Ang Ⅱ的升压活性[36]。

（5）前血管紧张素-12：

最新加入血管紧张素肽类家族的是前血管紧张素-12，是血管紧张素原分裂后形成额12肽，在肠道、脾脏、肝、心和肾脏均有发现，在高血压大鼠中明显增加。前血管紧张素-12可通过糜蛋白酶和Ang Ⅱ结合，诱导大鼠冠状动脉的血管收缩[37]。

5.血管紧张素Ⅱ的受体

作为人体内RAS中最主要的效应因素，血管紧张素Ⅱ的受体有两种亚型（AT1和AT2），二者均为有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体，但分别由不同的基因编码，AT1基因位于3号染色体；而AT2基因则位于X染色体上，结构上二者仅有34%序列同源性，同源区大部分集中在跨膜的疏水区，这些区域分布着Ang Ⅱ与AT1受体结合的残基，因此可以解释为Ang Ⅱ与AT1受体在此结合，而且二者介导的AngⅡ的生物学效应也是截然不同的。AT1受体和AT2受体最大的差异有报道是位于第三细胞内袢，而且有人指出更多的差异存在于羧基的终端尾部。

（1）AT1及其介导的生物学效应：

啮齿类动物中AT1包括两种亚型（AT1a和AT1b），分别位于第17号和第2号染色体上。而在人类，猪和牛的基因组中则只有一种基因型。AT1a主要存在于鼠的心脏、动脉和肾脏，而AT1b则主要存在于肾上腺、垂体、睾丸，仅微量表达在肾脏和大脑。AT1a和AT1b的氨基酸序列具有95%的同源性，在与配体结合、活化特性、信号途径等方面均不能用药物将其区分开来，然而二者在mRNA的非编码区序列却有着显著的差异。

高血压是AngⅡ的主要生物学效应，AngⅡ和AT1受体结合后可以通过多种分子信号机制收缩血管，升高血压，并与醛固酮的释放有关。AngⅡ通过刺激NADPH氧化酶造成的损害可以通过ROS依赖性机制和非ROS依赖性机制，造成血管损害、细胞增殖和炎症反应等，最终导致靶器官血管供血不足。研究表明AngⅡ过多可促使细胞周期调节蛋白p27/p21分泌过多，细胞停留在G1期造成细胞肥大。AngⅡ可通过刺激TGF-β1的产生，与其受体相结合，促进细胞外基质的积聚。AngⅡ还可通过刺激TGF-β1的产生而使金属蛋白酶合成减少，金属蛋白酶抑制剂合成增多，从而使胶原降解减少，打破ECM合成和降解的平衡失调，造成ECM过多积聚。AngⅡ可促进多种趋炎症介质的产生，如黏附分子、VCAM-1、ICAM-1、选择素、整合素、化学趋化因子、细胞因子、生长因子以及ET-1、PTHrP等。

（2）AT2以及肾素受体介导的生物学效应：

以往认为AT2主要分布于胎儿的组织器官中，出生后表达水平下降，仅以低水平表达于心肌、血管、肾脏、脑、卵巢等器官中。近来发现AT2受体也表达在很多成熟组织中，如在肾上腺皮质、大血管、中枢系统和肾脏皮质、髓质中都有AT2受体分布。

与AT1的血管收缩和生长活性相反，AT2受体兴奋主要通过多种机制拮抗部分由AT1受体所激发的血管收缩、细胞肥大、间质纤维化等不良作用，参与介导血管舒张和细胞凋亡等效应而保护心脏、肾脏等靶器官。其分子机制为：①一系列蛋白磷酸酶的活化，使不同的信号分子（如细胞外调节激酶ERK等）去磷酸化，关闭和阻止组织增殖信号通路；②AT2诱导的凋亡可能与其诱导的磷脂代谢物（可能为N-脂酰鞘氨醇）的积聚有关；③诱导激肽和NO系统的活化，使缓激肽和NO合成增多，血管舒张。

ARB与ACEI对AT2受体作用是不同的。ACEI通过抑制ACE，使血浆AngⅡ水平下降，对AT1受体和AT2受体的刺激都减少，从而起到保护靶器官的作用。应用ARB并不能降低血浆AngⅡ水平，并且由于和AT1受体的结合被阻断，AngⅡ更多地刺激AT2受体，而产生保护心脏，扩张血管，抗心律失常，抗纤维化和细胞生长的作用。

二、系统RAS和局部RAS

RAS在体内的作用由系统作用和局部作用两部分组成。系统RAS的作用是通过血流动力学应付急性生理状态为主，参与维持血压和心搏出量，但是这部分作用不超过40%。另外一个重要的部分是局部RAS，也叫作组织RAS，它在体内的作用缓慢且持续，主要参与组织修复改造和结构重塑。研究发现体内很多脏器都能产生RAS的各个组分，而以自分泌和旁分泌的形式形成局部RAS，比如心脏、肾脏、脑、血管、肾上腺、胰腺、部分免疫细胞、脂肪组织甚至肿瘤组织等都存在局部RAS。

局部RAS的特点和系统RAS不同，局部形成AngⅡ，其兴奋可与系统RAS完全无关，比如糖尿病状态下，系统RAS由于血容量增加，入球小动脉压力增高，处于抑制状态，但是此时肾脏局部的RAS却是兴奋的；其次，局部RAS的作用方式不同于系统RAS的血液循环方式，它是以自分泌、旁分泌方式发挥作用的；局部AngⅡ浓度远比系统中RAS浓度高，比如肾脏间质AngⅡ浓度的浓度是血浆中AngⅡ浓度的80倍；它可与局部AT1受体高比例结合而发挥作用；局部RAS常常可以缓慢长期兴奋；此外，还有一个非常重要的特点，就是局部AT1受体除了可被AngⅡ激活外，很多其他因素也可激活，例如LDL、胰岛素、牵张刺激，雌二醇、促红细胞生成素、蛋白尿、某些细胞因子等都可以激活AT1受体。

三、RAS在肾脏疾病中的意义

目前认为许多肾脏疾病的发生均有RAS过度兴奋的参与，包括循环RAS及组织局部RAS两部分。局部RAS的作用日益受到人们的重视，肾脏局部RAS主要存在以下几个部位。①近端肾小管：存在大量血管紧张素原，也可合成肾素，刷状缘有极丰富ACE；②系膜细胞：有肾素及糜蛋白酶等；③足突上皮细胞：可合成血管紧张素原；④间质细胞：有大量AT1和AT2受体，ACE、糜蛋白酶、组织蛋白酶和紧张肽等可通过ACE及非ACE途径生成AngⅡ。在各种病理情况下如压力、牵拉刺激使RAS各组分活跃：足突细胞AngⅡ及其受体上调；系膜细胞中产生过多AngⅡ以及上调ATR引起高血压，肾内血流动力学异常，产生蛋白尿，引起肾小球硬化和肾间质纤维化等等。

（一）高血压

高血压是AngⅡ的主要生物学效应，AngⅡ和AT1受体结合后可以通过多种分子信号机制收缩血管，升高血压，并与醛固酮的释放有关。另外，许多可能导致高血压的原因可以兴奋AT1R，从而通过对周围血管的病变致使高血压发生与发展。

（二）肾内血流动力学异常

AngⅡ可以收缩出球小动脉，增加入球小动脉钙离子浓度影响入球小动脉在血压改变时的肌源性调节作用；作用于致密斑干预肾小管-肾小球反馈促使压力排钠曲线左移；使肾间质AngⅡ水平过高影响排钠调节，从而升高血压。由于AngⅡ收缩出球小动脉的强度大于对入球小动脉的收缩，导致肾小球囊内压增高，对肾小球内血管、系膜细胞牵张刺激增强，兴奋足突上AT1受体，导致系膜细胞表达血管紧张素过多，促进蛋白尿、肾小球硬化形成。肾小球囊内压增高引起机械牵张，压力刺激通过代谢通路葡萄糖转运子1（GLUT-1）表达增加，促进葡萄糖及其代谢产物作用。

（三）蛋白尿

RAS系统作用于肾脏疾病引起蛋白尿的机制有很多：AngⅡ可改变滤过膜孔径而促进蛋白尿的生成；通过对血流动力学影响，增加肾小球囊内压；改变肾小球选择滤过屏障，减少上皮足突上阴电荷（PC结构），影响足突上皮细胞裂孔间nephrin，NEPH1，P-Cadherin等蛋白；诱发局部ROS形成；激发小管间质补体通路；诱发局部RAS兴奋。AngⅡ还通过调节钠氯通道蛋白（NSCC），调节钙离子浓度破坏细胞骨架结构；足突细胞依靠Ⅳ型胶原（α3，α4，α5）黏附于肾小球基底膜，AngⅡ破坏Ⅳ型胶原（α3，α4，α5）黏附作用促进足突细胞凋亡和脱落。

（四）肾小球硬化与肾小管间质纤维化

AngⅡ与受体结合后通过Smad、CTGF等导致纤维化；肾素、醛固酮等也参与了纤维化及炎症形成。

（游怀舟　郝传明）

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第四节　盐皮质激素和醛固酮

哺乳动物细胞外液量和血压的控制与上皮离子转运的调节密切相关。醛固酮是调节上皮细胞离子（尤其是Na+、K+和Cl–）转运的主要激素。除此之外，近年来还发现了醛固酮与脏器纤维化的关系，以及认识到醛固酮的肾上腺外合成途径，以及基因（genomic）和非基因（non-genomic）作用方式，醛固酮日渐受到广泛重视。

一、醛固酮的合成

（一）途径

目前已证实醛固酮的合成有两条途径：肾上腺合成途径和肾上腺外局部合成途径。肾上腺合成途径是经典的醛固酮合成途径，由肾上腺球状带细胞分泌，分泌速率为50～200μg/d，血浆浓度为200～500μg/dl。图1-8-4-1显示的是醛固酮的合成途径，可以看出醛固酮合成的最后关键步骤是在醛固酮合成酶，或称细胞色素P450酶11B2（CYP11B2）的催化下，依次经过11β-羟化，18-羟化和18-甲基氧化的过程，最后形成醛固酮。

肾上腺外局部合成途径于近年证实。20世纪90年代起，人们不断地在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、肝储脂细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、脑等多处发现了醛固酮合成的关键酶基因——CYP11B2，提示局部醛固酮合成途径的存在。而且这一途径合成的醛固酮并没有被运输到全身，通过旁分泌和自分泌在局部发挥作用。

（二）影响因素

肾上腺球状带醛固酮的分泌主要受血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和血浆K+水平的调节，以适应急性循环容量降低、慢性钠缺乏或钾负荷过多等情况。高水平的心房利钠肽，以及给予肝素、生长抑素和多巴胺可使醛固酮分泌减少。研究发现体外脂肪细胞来源的分子可刺激醛固酮的分泌，其在代谢综合征中的作用推测与此有关[1]。

与肾上腺合成途径相同，局部组织中醛固酮的合成也主要受血钾和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的影响，这二者的升高都会促进CYP11B2mRNA表达增加，使醛固酮合成量增多。肿瘤坏死因子（TNF）能够抑制血钾和AngⅡ的这种作用。

血管紧张素和血浆K+主要是通过增加关键的类固醇生成酶以及类固醇生成急性调节蛋白（StAR）的表达和活性以刺激醛固酮分泌[2]。近来的研究还发现肾上腺球状带对醛固酮产生的调节作用。Choi等发现在超过三分之一的产生醛固酮的肾上腺瘤中存在K+通道Kir3.4的突变（由KCNJ5基因编码）[3]。这些突变增加了Na+通过Kir3.4的传导，导致Ca2+内流的增加和醛固酮产生的增多，以及球状带细胞增生。另外，KCNJ5的遗传突变与双侧肾上腺增生的高血压相关[4]。这些发现提示KCNJ5可抑制醛固酮的产生和球状带细胞的增生。

二、醛固酮的病理生理作用

目前发现醛固酮通过基因和非基因二种方式，在体内发挥病理生理作用。

（一）基因方式（genomic actions of aldosterone）

1.途径

在醛固酮的研究中，人们最先认识的就是这一方式，因此也称为经典作用方式。这一机制是通过盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor，MR）介导。所有脊椎动物的MR高度保守，可分成三个主要的结构域：①N-端转录调节域；②中心DNA结合域；③C-端配体/激素结合域（LBD）。

无激素存在和作用时，MR散在胞质和胞核内，与一些伴侣分子，包括热休克蛋白Hsp90和免疫亲和蛋白Hsp56结合，处在无活性状态。醛固酮与MR结合时，伴侣分子脱落，暴露核定位信号，MR迅速向核内聚集，形成醛固酮-MR复合物簇，识别并结合靶基因上专一的DNA顺序，即激素调节元件（hormone response elements HRE：由15个核苷酸组成的AGAACAnnnTGTTCT的回文序列），发挥转录调节因子的作用，诱导靶基因转录、翻译，最后产生醛固酮诱导蛋白（aldosterone-induced proteins，AIPS），发挥生物效应。这一作用机制的特点是作用时间长（从启动到发挥效应至少1小时以上），对转录抑制因子放线菌素D和翻译抑制因子放线菌酮敏感，还能被醛固酮拮抗剂螺内酯所抑制。

事实上，体内MR与糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）具有高度同源性，DNA结合区有94%的氨基酸相同，配体结合区有54%相同。因此皮质酮、皮质醇和MR的亲和力与醛固酮相同。此外，血浆中糖皮质激素的浓度是醛固酮的1 000倍。体内保证醛固酮特异作用的机制有：①有一种NAD＋依赖的11β-羟类固醇脱氢酶2（11β-HSD2）与MR共同存在，它能把皮质醇、皮质酮分别转化为可的松、11-脱氢皮质酮，这二种物质几乎不与MR结合，11β-HSD2对醛固酮没有作用，使醛固酮仍能与MR保持高亲和力。②醛固酮与MR的解离率是糖皮质激素的1/5。

2.作用

通过基因作用方式，醛固酮可以调节钠的吸收和钾的分泌。醛固酮主要作用于远端肾单位，包括从末端远曲小管到集合管，和全部皮质和髓质集合管。这些节段MR丰富，称为醛固酮敏感远端肾单位（aldosterone-sensitive distal nephron，ASDN）[5]。醛固酮对ASDN的作用主要分成三个阶段：潜伏期、早期和晚期。潜伏期约15～20分钟。早期作用主要包括对MR依赖的信号分子，如血清和糖皮质激素调节激酶1（serum-and glucocorticoid-regulated kinase1，SGK1）的调节，增加上皮钠通道（ENaC）的开放概率[6,7]。晚期作用是醛固酮刺激的一系列效应基因的转录，包括编码离子通道成分的基因，如ENaC和ATPase亚单位。主要的直接作用是增加Na+的重吸收，伴随着Cl-的重吸收，和/或K+的分泌，最终引起水的重吸收。

除此之外，目前引人注意的是醛固酮已被证实是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激因子之一，可以促进心血管和肾脏纤维化。具体作用机制尚不完全清楚，主要有以下几点发现：①血管平滑肌细胞的实验提示，醛固酮有促进AngⅡ受体AT1表达增加的作用[8]，随后研究发现醛固酮-MR复合物可以与心肌中AngⅡ受体AT1基因启动子部分的HRE结合，促进基因表达，AT1上调，最终增强AngⅡ促心肌纤维化的作用[9]；②研究发现醛固酮可以刺激TGF-β1的表达，目前已证实组织的损伤和纤维化与TGF-β1有关[10,11]；③醛固酮促进纤溶酶激活抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）表达增加，抑制纤溶酶的产生，造成体内细胞外基质堆积，并且最近研究显示在血管平滑肌细胞和内皮细胞内可能是与AngⅡ协同作用[12,13]；④醛固酮可以激活核转录因子AP-1、NF-κB，尤其是AP-1，两者都能促进ECM的基因转录、翻译[14]；⑤组织培养的研究发现，醛固酮能降低白介素-1β诱导的NO的生物活性[15]，螺内酯又能刺激它的活性，改善内皮细胞的血管舒张功能，抑制AngⅡ和AT1的结合[16]；⑥醛固酮可能诱导氧自由基和过氧化氢生成增多，从而参与组织损害[17]；⑦如前所述，醛固酮对上皮钠通道的水钠代谢调节作用与泛素连接酶Nedd4-2-SGK通路有关，近来发现它与囊性纤维化病变可能也有关。

（二）非基因方式（non-genomic action of aldosterone）

1.途径

在某些情况下，如立位晕厥、急性容量不足时，醛固酮的分泌可快速增加，此时起作用的是醛固酮的非基因作用方式。虽然这种快速的非基因方式大多由经典的MR活化介导，近来有研究发现在培养的内皮细胞上有与醛固酮呈高亲和力结合的非MR的膜结合位点[18]，醛固酮与之结合后，通过第二信使的级联反应被触发。非基因作用方式的特点是作用迅速（几分钟之内），对转录抑制因子放线菌素D和翻译抑制因子放线菌酮不敏感，大多不被经典盐皮质激素受体拮抗剂螺内酯所拮抗[19]。

2.作用

醛固酮作用的许多上皮细胞（集合管、结肠上皮）和非上皮细胞（白细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞）都存在这种快反应的非基因作用方式。目前人们所了解的由这种方式产生的生理和病理作用，主要有以下几种：①醛固酮能促进细胞Na＋/H＋交换，使细胞内pH升高。这一作用可能与醛固酮刺激细胞内PKC和前列腺素合成，促进快反应信号转导有关；②醛固酮能促进心肌细胞Na+-K+-2Cl-的协同转运，可能机制同①；③醛固酮在体内能减弱压力感受器的敏感性，降低心率变异性，这个作用受肾上腺素能系统的影响，这一机制可能参与高血压和心衰的发生。

三、醛固酮与肾脏病进展的关系

大量研究证实，醛固酮可以促进心肌纤维化、心室重构[20]。临床上心肌梗死和严重心力衰竭患者在ACEI或ARB治疗同时，给予螺内酯可获得了良好的收效[21]。近年无论是动物还是临床证据均提示，肾脏病变进展中醛固酮也占有重要地位[22]。

（一）体外和动物研究

5/6肾切除模型和多柔比星肾病综合征模型的大鼠都表现出明显的高醛固酮血症，可达正常的10倍以上，动物表现为高血压、蛋白尿和肾小球硬化[22]。使用ACEI或ARB类药物后伴随着醛固酮水平下降，病变明显减轻。外源再给予醛固酮，以上症状和肾脏病变又加重[21]。另一些动物模型，如SHR和SPSHR大鼠、环孢素中毒性肾病等，肾脏损伤的同时也都伴有不同程度的醛固酮水平升高，应用醛固酮拮抗剂或肾上腺切除后，肾脏损害都能有所减轻，以上模型血管紧张素是参与其中的。对于盐皮质激素-高盐饮食的高血压实质性肾小球损伤大鼠，肾素产生受抑制，ACEI/ARB药物治疗也无效，强烈提示醛固酮对慢性肾脏病变的发展起着重要的、独立的促进作用。

（二）临床研究

醛固酮对肾脏疾病进展的作用机制已经被逐步认识，临床上亦有证据表明使用醛固酮受体拮抗剂有一定的心、肾保护作用。目前醛固酮受体拮抗剂主要有螺内酯与依普利酮（eplerenone）。依普利酮是第一个获准上市的高选择性醛固酮受体拮抗剂，抗盐皮质激素活性高于螺内酯，与性激素受体亲和力低，可以有效地避免性激素样不良反应。

目前许多研究显示，依普利酮不仅能显著降低肾素性高血压和顽固性高血压，还能逆转和抑制心肌纤维化，降低病死率[23]。在肾脏方面，也有研究发现在应用ACEI/ARB的基础上加用醛固酮拮抗剂可以降低蛋白尿，缓解肾小球硬化，延缓CKD进展。依普利酮能更明显地缓解盐敏感性高血压大鼠蛋白尿和肾小球硬化[24]，并且也能更显著地降低肾脏TGF-β水平，从而延缓肾脏纤维化的发展。它在糖尿病肾病和残余肾模型[25]中，通过对残余肾模型大鼠肾小球滤过率、血压、肾小球硬化指数及尿蛋白的观察，也发现螺内酯对残余肾功能有一定的保护作用。

根据目前研究，人们对醛固酮有了新的认识，打破了仅由肾上腺皮质合成，主要调节钾、钠代谢的传统概念，越来越重视其对维持内环境稳定、保证生理功能正常运转的作用。需要通过更大量的、长时间观察的随机对照研究进一步深入探讨醛固酮拮抗剂在临床应用的前景，能最终有助于诸如高血压、心功能衰竭和肾脏纤维化等疾病的治疗。

（游怀舟　郝传明）

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第五节　血管升压素

一、血管升压素概述

血管升压素（vasopressin，VP）也称为血管加压素或抗利尿激素（antidiuretic hormone，ADH），是一种九肽激素，在人类及大多数哺乳动物中第八位氨基酸残基为精氨酸，故又称为精氨酸血管升压素（arginine vasopressin，AVP），以区别于存在于猪的赖氨酸血管升压素。人类90%原尿（约180L/天）在肾脏近端小管及髓袢降支重吸收，剩余10%在集合管接受VP的调节。VP在肾脏介导水重吸收，若该过程发生异常，可导致尿崩症（diabetes insipidus，DI）。

（一）血管升压素的合成与释放

血管升压素由下丘脑视上核（supraoptic nucleus）和室旁核（paraventricular nucleus）合成，合成的前体氨基末端包含血管升压素分子，羧基末端包含糖肽。含前体的分泌颗粒沿下丘脑-垂体束轴突运送，运送过程中血管升压素与运载蛋白分离，最终储存于神经垂体，直至接受刺激释放入血。

短时间内血浆渗透压升高或血容量减低可刺激VP释放。细胞外液渗透压升高可刺激视上核附近的渗透压感受器，令VP合成增多，血浆渗透压提升1%即可使血浆VP浓度明显升高。血容量改变可刺激左心房和颈动脉窦的压力感受器，通过迷走和舌咽神经传至下丘脑调节VP合成，通常需要减低5%～10%才会刺激VP释放。此外AngⅡ、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、乙酰胆碱、前列腺素等均能刺激VP释放。

（二）血管升压素的作用

血管升压素有V₁R和V₂R两种受体，前者分布于血管平滑肌，激活钙离子途径导致平滑肌收缩，血管阻力增加；后者主要分布于肾脏集合管及髓袢升支粗段，参与形成水通道浓缩尿液。VP在肾脏激活V₂R，进而导致水通道蛋白2在集合管主细胞顶端质膜聚集，增加水通透性，介导水的重吸收。VP不仅在血浆渗透压或血容量的快速改变时起到调节作用，在长期缺水过程中，VP也可通过刺激AQP2基因转录，提升肾脏浓缩能力[1-3]。除此之外，VP还可作用于一些内皮细胞参与凝血相关因子释放及NO生成等，有待进一步研究。

二、血管升压素在肾脏的作用与机制

血管升压素在肾脏的作用机制主要是刺激2型血管升压素受体并调节水通道蛋白，从而改变集合管上皮细胞对水的通透性，促进尿液浓缩。

（一）2型血管升压素受体

2型血管升压素受体（type 2 vasopressin receptor，V₂R）是一种七次跨膜的G蛋白偶联受体[4,5]，在肾脏中表达于集合管主细胞以及髓袢升支粗段[6-8]。其结构特点主要包括：①胞外N端糖基化位点；②两个保守半胱氨酸残基位于第二、三胞外袢，参与分子折叠及稳定配体结合域；③C端十六烷酰化位点，可能参与细胞内吞及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导；④包含双亮氨酸基序的C端疏水残基，参与内质网转运[9]；⑤胞内C端和胞内袢上多个丝氨酸及苏氨酸磷酸化位点，影响受体的胞内循环[10-12]。

VP与V₂R结合后，V₂R的胞内C端与位于主细胞和升支粗段基侧质膜的异源三聚体G蛋白的G_s相互作用[13]，使之解离为G_α和G_βγ亚基，腺苷酸环化酶被激活，胞内cAMP水平增高，激活蛋白酶A（protein kinase A，PKA），使包括AQP2在内的蛋白发生磷酸化。AQP2继而在集合管主细胞的顶端质膜聚集，作为水通道促进基于渗透压差异的水重吸收。VP作用也可同时经钙调蛋白提高胞内钙离子水平[14]，参与AQP2的胞内转运。

与VP结合后V₂R在细胞表面的表达下调，一方面由于胞内V₂RmRNA水平降低，另一方面与抑制性G_i蛋白[15,16]和网格蛋白介导的细胞内吞[17,18]有关。G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRKs）可磷酸化V₂R，其中GRK2和GRK3导致的V₂R磷酸化可诱导受体减敏和β抑制蛋白（β-arrestin）募集。β抑制蛋白与V₂R复合物可募集网格蛋白适应蛋白2（clathrin adaptor protein 2）[16]，协助网格蛋白介导的细胞内吞。抑制蛋白还可将V₂R从G蛋白解离[19]。被内吞的V₂R与VP配体一起进入核周的溶酶体或内体降解[20,21]。V₂R在细胞表面下调直至恢复VP刺激前水平需要数小时[10,22,23]，在这过程中有新的V₂R合成[21]。

（二）水通道蛋白家族

自1988年Peter Agre发现首个水通道蛋白（aquaporins，AQPs）即AQP1[24]以来，迄今已在哺乳动物中发现13个成员[25]，广泛分布于全身，这些通道蛋白对水、尿素、甘油及其他小分子溶质具有不同程度的通透性[26]，其中AQP1～4，6～8，10～11分布于肾脏。

对血管升压素敏感的水通道蛋白2（aquaporin 2，AQP2）位于肾脏集合管主细胞。VP与V₂R的作用后，水通道蛋白2通过细胞内囊泡转运到主细胞腔面顶端质膜，增加水的通透性介导水的重吸收。该蛋白在尿液浓缩中起关键作用。

水通道蛋白2跨膜6次，包含271个氨基酸，N端及C端均位于胞质内。有4个主要的磷酸化位点位于C端，包括S256，S261，S264，S269，其中S256位点作为蛋白酶K的作用靶点与VP刺激后AQP2在聚集顶端质膜的过程相关，并可调节邻近位点的磷酸化作用，S264和S269的磷酸化需在S256磷酸化后发生[27]。但S261的磷酸化与其他位点无关[28]。这些磷酸化位点的具体作用目前仍不明确。

Wade等于1981年基于对两栖动物上皮的观察，首先提出“穿梭假说”（the shuttle hypothesis）认为VP刺激使某种位于胞内囊泡里的“水通道”与细胞顶端质膜融合，在洗脱VP后该水通道可通过内吞作用返回细胞内[29]。AQP2被发现后经抗体鉴定认为主要分布在集合管主细胞顶端质膜和胞内囊泡中[30,31]。VP结合V₂R后通过兴奋性G蛋白激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP增加，继而经蛋白酶A锚定蛋白（PKA-anchoring proteins，AKAPs）募集蛋白酶A至含有AQP2的细胞内囊泡[32,33]，AQP2随之被转运至顶端质膜（位于AQP2 C端的S256位点被磷酸化导致内吞减少在其中发挥了重要作用[34,35]），导致主细胞对水的通透性增加，同时由于基侧AQP3[36]和AQP4[37]的水通道作用，使周围肾脏间质渗透压与集合管腔内液体趋同。AQP2转运过程中的具体调节机制目前仍不明确，肌动蛋白、微管、SNARE蛋白（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors）等被认为可能参与了这一过程。

AQP2在顶端质膜的聚集可通过洗脱VP、应用V₂R拮抗剂或增加水负荷所逆转解除[38-40]。AQP2经网格蛋白小窝（clathrin-coated pits）由细胞内吞作用回到胞内囊泡中后[17,41,42]，主细胞顶端质膜对水的通透性随之降低。在蛋白合成受抑制时，部分AQP2可被循环复用而不需重新合成[43]。通过大鼠研究发现，部分AQP2会聚集于一些细胞结构如多泡体（multivesicular bodies，MVBs）中[38]，继而可被转运至溶酶体降解，或转移至其他由MVB衍伸出的细胞结构中，或直接返回顶端质膜。泛素化可能参与了部分被内吞AQP2的最终路径。返回顶端质膜的AQP2则有可能作为外泌体（exosomes）成分被排入集合管腔[44,45]，并可在尿液中被检测到。事实上，即使没有VP刺激，AQP2也在主细胞内进行循环往复的转运，其在到达细胞表面前的载体目前尚不明确。新合成的AQP2可能经由高尔基体反面网状结构（TGN）或某种网格蛋白包被的核内体（endosome）转运[46-48]。

水通道蛋白3和4位于主细胞基侧质膜，AQP4对水具有高通透性，而AQP3通透性较低[49]。AQP3在肾脏皮质表达较多，随着接近髓质而表达减少，而AQP4的分布则相反[50,51]。然而AQP3敲除小鼠可有明显的浓缩功能障碍[36]，较AQP4缺失时更为明显。这两种蛋白的表达及功能可能也受VP或脱水的调节[50,52]。AQP2在主细胞的基侧质膜也可表达，在肾脏内髓质可随VP作用而表达增加，但意义目前尚不明确。

三、血管升压素作用异常与疾病

（一）中枢性尿崩症（central/neurohypophyseal diabetes insipidus，CDI）

发病原因是血管升压素合成与释放功能障碍[53,54]。遗传性CDI与编码VP-运载蛋白（VP-neurophysin Ⅱ，VP-NPⅡ）前体的基因突变相关[53]，而获得性CDI可由多种原因导致的神经垂体损伤造成。此时V₂R和AQP2基因及蛋白多无明显异常。VP或VP类似物dDVP替代治疗可增加AQP2的胞内转运，并可激活AQP2基因转录提升AQP2蛋白表达，从而改善水重吸收[55,56]。

（二）肾性尿崩症（nephrogenic diabetes insipidus，NDI）

肾脏对VP反应不足导致的尿液浓缩功能下降，多由V₂R和AQP2功能障碍造成，如果不得到及时纠正，可导致脱水、高钠血症、膀胱扩张及中枢神经系统损伤等严重后果。依据发病原因可分为遗传性和获得性NDI。

1.遗传性NDI

依据突变基因位于V2R或AQP2可分为1和2型遗传性NDI。90%遗传性NDI由X连锁隐性遗传的V₂R基因突变造成[57,58]，为1型遗传性NDI。目前已发现了200个以上相关突变位点，表现为错误折叠（如L62P，S167L，R143P，Y205C，Q292ins，V226E，R337X等）、胞内转运障碍（如R137H）或与VP结合障碍（如R181C，G185C，Y205C等）。可入胞的非肽类V₂R拮抗剂可能增加突变V₂R在细胞表面的表达[59]从而改善病情，相关的治疗还在进一步研究中。2型遗传性NDI约占10%，由AQP2基因突变造成，已发现40余个突变位点，其中80%为常染色体隐性遗传。由于错误折叠，内质网中积蓄及降解作用，导致AQP2不能正常转运锚定在质膜上[60]，或插入顶端质膜却没有功能。治疗无特效疗法，可予低盐饮食，氢氯噻嗪、阿米洛利等利尿剂，COX抑制剂，磷酸二酯酶抑制剂可能有效[61]。

2.获得性NDI病因复杂，较常见者如下所述：

（1）急性肾损伤和慢性肾脏病可有多种肾小球及肾小管功能障碍，从而引起浓缩功能障碍和多尿。急性肾损伤模型的AQP1～3表达均可显著减少[62,63]，慢性肾脏病时V₂R的RNA缺失，均可引起集合管对VP的反应降低。

（2）电解质紊乱：低钾血症可造成AQP2水平显著下降[64]，从而引起严重多尿。高钙血症可使AQP2、AQP1、AQP3下调[65]，同时导致VP调节的K+-Na+-2Cl-协同转运体2（NKCC2）和Kir 1.1钾通道功能减退[66]，继而降低髓袢升支粗段钠重吸收，影响逆流倍增作用。

（3）输尿管梗阻双侧输尿管梗阻会导致AQP1～4表达均下降[67,68]，由于AQP2和AQP3会持续低表达，因此多尿可能持续到梗阻解除后2周。COX-2抑制剂可预防AQP2水平下降，减少梗阻后多尿[69,70]。RAAS系统也参与双侧输尿管梗阻引起的NDI，有研究证实ARB也可用于预防梗阻后AQP2下调[71]。单侧输尿管梗阻不会引起水分和溶质排出的改变，因健侧可有能力进行代偿。

（4）锂制剂：约30%接受锂制剂治疗的患者可出现NDI。锂通过PKB/Akt激酶和MAPK途径影响许多与细胞增殖、坏死、凋亡相关蛋白的合成，影响细胞内信号转导，从而降低腺苷酸环化酶活性，胞内cAMP减低，AQP2和AQP3表达减少且质膜定位功能降低。前列腺素可能参与了其作用，可用NSAIDs治疗锂制剂引起的NDI。另噻嗪类和阿米洛利也可用于治疗锂制剂引起的NDI。

（三）肝硬化和充血性心力衰竭

这两种疾病均可有水钠潴留、细胞外液增多的表现。不同类型的肝硬化AQP2表达差异很大，代偿期肝硬化AQP2则可减低，而严重肝硬化时AQP2显著增多。充血性心力衰竭可有AQP2水平增高和顶端质膜聚集增多，发生机制可能是有效容量下降导致循环VP水平上升，引起水潴留和低钠血症[72,73]。应用V2R拮抗剂可促进排尿并减少AQP2表达。

（四）抗利尿激素分泌不当综合征和VP逃逸抗利尿激素分泌不当综合征（the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion，SIADH）

低钠血症的主要原因之一，肺及中枢神经系统的血管疾病、感染和肿瘤是常见的病因。研究发现SIADH时AQP2表达水平上升[74]。VP逃逸是暴露于长时间VP作用后出现的限制低钠继续进展的生理过程，表现为尿量突然增多，此时尽管循环VP水平高，尿渗透压仍然偏低。在动物模型中发现AQP2显著下降，而AQP1、AQP3、AQP4水平不变[75,76]，提示这一生理现象与不依赖VP的AQP2低表达有关。

（徐宁馨　郝传明）

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第六节　激肽释放酶-激肽系统

一、概述

激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system，KKS）是一个由肽类激素、受体及肽酶等组成的复杂网络系统。1909年Abelous等[1]首次报道静脉注射人尿液可引起狗的血压短暂下降，推断尿中存在降压物质。1930年Kraut等[2]在狗的胰腺内发现高浓度此物质，命名为“Kallikrein”，即激肽释放酶。KKS包括四种成员，即激肽释放酶，其底物激肽原，效应激素激肽及灭活激素激肽酶[3]。KKS是维持血压平衡中降压系统的重要组成部分，并参与调控体内水电解质转运、细胞生长、毛细血管通透性及炎症反应等多种病理生理反应。

（一）KKS的组成

人类只拥有单一的激肽原（kininogen）基因，位于染色体3q26，其编码的激肽原是单链糖蛋白，主要由肝脏合成。由于转录后剪切方式的不同，分为高分子量激肽原（HMWK，626个氨基酸，88～120kD）和低分子量激肽原（LMWK，409个氨基酸，50～68kD）两种形式。

激肽释放酶（kallikrein，KLK）属于丝氨酸蛋白酶，分为血浆型及组织型，由完全不同的基因编码，在分子量、氨基酸组成、免疫学活性、释放激肽的类型及生物功能方面均有很大的差异[4]，仅有的共同特点是两种酶都从激肽原中释放激肽（kinin）。血浆型激肽释放酶由肝脏合成，大脑中也有表达[5]，存在于血液循环系统中，仅从HMWK中释放缓激肽（bradykinin），参与凝血级联反应和中性粒细胞的活化等。血浆型激肽释放酶不存在于肾脏中，而且由于肾小管及血管内皮细胞强大的激肽酶（kininase）活性，所以循环中的激肽可能对肾脏功能没有影响。

组织型激肽释放酶基因属于激肽释放酶基因超家族[6]，后者位于第19号染色体短臂q13.3-13.4，包含至少15个基因（KLK1～KLK15），但仅有KLK1参与组织局部激肽的释放产生。KLK1在肾脏、动静脉、心脏、大脑及肾上腺等与心血管功能调节相关的组织以及胰腺、唾液腺、腺垂体和子宫内膜等中都有广泛的表达。组织型激肽释放酶转录后首先产生245个氨基酸构成的组织型激肽释放酶原，去掉N端6个残基后转变为活性形式。组织型激肽释放酶具有强大的活性，可以释放胰激肽（kallidin），或称赖氨酸缓激肽（lys-bradykinin），以及缓激肽。虽然激肽释放酶的主要生理功能是促进激肽的产生，但是它也可直接作用于激肽受体或不依赖受体发挥其功效。

人体内激肽包括胰激肽与缓激肽[7]，主要以局部激素形成自分泌或旁分泌。血浆氨基肽酶可通过裂解胰激肽N端第一个赖氨酸残基而使之转变为缓激肽。激肽一般通过与两种不同类型受体即B1受体和B2受体结合来发挥作用。B1和B2受体有36%的同源性，都是G蛋白耦联的7次跨膜受体[8]。B2受体广泛分布于血管内皮细胞、肾脏、心脏、骨骼肌、神经系统，以及气管、肠道、子宫、输精管和膀胱等组织。其中，在动脉和小动脉上的分布存在差异：在动脉，它主要分布于内皮而非平滑肌细胞；在小动脉，则主要分布于血管中膜而非内皮细胞[9]。B1受体的分布与B2受体类似，在正常情况下其表达水平较低，但在炎症刺激时，如脂多糖、内毒素、细胞因子如IL-1β和TNF-α存在时[10]，以及糖尿病和缺血再灌注损伤时水平上调[11]。B2受体与胰激肽和缓激肽均可结合，而缓激肽与B1受体结合基本不产生功能效应。刺激B1或B2受体后均可引起内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）活性增加和内皮细胞内前列环素（PGI）合成增多。除此之外，花生四烯酸活性代谢产物、内皮源性血管舒张因子及组织纤溶酶原激活物等可能也参与介导激肽的部分生物效应。

激肽的生物半衰期很短仅有10～30秒，它可以被多种酶降解，包括激肽酶Ⅰ、激肽酶Ⅱ（即血管紧张素转化酶ACE）和中性内肽酶（NEP）等[12]。激肽酶Ⅰ可裂解激肽C端的精氨酸残基，生成可与B1受体结合的脱精氨酸衍生物。ACE和NEP等去除激肽C端2个氨基酸，使激肽降解为无活性的物质（图1-8-6-1）。

（二）肾脏的KKS

肾脏表达KKS的所有组分。激肽释放酶在肾脏皮质集合管中产生[13]，其表达受雌孕激素、摄盐量、甲状腺激素以及糖皮质激素的影响[14-16]。而激肽原则在同一肾单位的集合管下游产生，这种解剖上的近距离使激肽在集合管中形成并在其管腔面以及管周间隙发挥作用，影响肾脏血流、电解质和水的排泄。一旦肾脏激肽释放酶被激活，它将作用于HMWK和LMWK释放胰激肽。激肽绝大部分生理功能的是通过B2受体介导，后者在肾脏皮质、髓质集合管和肾小球中有较高的水平[17]。正常肾脏中几乎不表达B1受体，但在脂多糖刺激后B1受体可显著表达于大鼠肾脏的出球小动脉、髓质细段和远曲小管中[18]。在近端小管刷状缘存在NEPⅡ，血管内皮细胞、肾小球、近端肾小管和远端肾单位的上皮细胞表面则有大量激肽酶Ⅱ即ACE表达。肾脏KKS的活性通常通过测定尿中激肽释放酶的浓度来判断，然而尿激肽释放酶的水平尚受到小管上皮细胞合成及分泌功能，激肽释放酶抑制因子和激肽酶，以及小管液的pH值与离子浓度的影响。

二、肾脏KKS的生理功能

（一）调节肾脏血流和水电解质代谢

肾脏KKS参与调控肾脏内血流动力学及小管功能，其利钠利尿效应在水电解质平衡方面起着重要作用。激肽可增加肾脏和肾乳头的血流量；使用特异性缓激肽抗体抑制内源性KKS活性后，等张盐水所致的利钠利尿作用消失，这些结果提示内源性激肽具有利钠利尿的效应。

KKS舒张肾脏血管的作用可能与内皮细胞产生的NO、PGI和内皮源性超极化因子（EDHF）有关。激肽还可以阻碍钠离子进入髓质内层集合管（IMCD）[19]。研究表明，B2受体缺陷的小鼠由于对抗利尿激素（ADH）反应增强而导致尿液浓缩，这说明正常情况下，内源性激肽通过B2受体来拮抗ADH的效应[20]。当激肽刺激皮质集合管的腔面时，约3分钟后前列腺素E（PGE2）生成可提高4～6倍，后者抑制集合管钠离子重吸收，因而PGE2水平增加可能介导了激肽的利钠作用。另外，激肽释放酶还可以影响肾小管钙的转运。对组织型激肽释放酶缺陷小鼠（B2受体正常）使用B1受体拮抗剂后，肾小管钙的吸收随之受损，表明此作用与激肽作用无关[21]。在远端小管缺陷而造成的钙离子代谢障碍的患者中也曾有组织型激肽释放酶基因功能缺失的报道[22]。

（二）调节肾脏生长发育

在肾脏成熟过程中，肾脏激肽释放酶表达随发育逐渐增加，而新生动物肾脏B2受体水平却远较成年肾脏高[15,23,24]。激肽释放酶抑制剂——抑肽酶（aprotinin）和B2受体拮抗剂可显著减缓新生鼠肾脏的成长，但对成年鼠没有影响，提示肾脏KKS可能在发育阶段对肾脏的生长有刺激作用。组织型激肽释放酶基因敲除小鼠（KLK-/-）的大多数组织不能产生有效水平的激肽，尽管血压正常，但早期心血管异常，这可表明组织型激肽释放酶对局部器官发育和血管新生有很重要的作用[25]。

（三）对抗肾脏细胞增生肥大的作用

KKS除了调节血流及水盐代谢等众所周知的功能之外，通过对拮抗B2受体的研究表明，激肽对系膜细胞、成纤维细胞和髓质间质细胞存在抗增生肥大的作用。其作用机制可能是B2受体与酪氨酸磷酸酶SH2结构域（SHP-2）的相互作用，并在原代培养的肾脏系膜细胞中通过免疫共沉淀法得到一定程度的证实。缓激肽的刺激可提高两者的作用反应和特异性SHP-2磷酸酶的活性[26]。相应的，当系膜细胞被SHP-2阴性的结构转染后，缓激肽便失去了抑制细胞增殖的作用。

（四）与RAS及其他血管活性物质的相互作用

KKS与RAS在人体的生长、发育、炎症、血压控制和肾功能调节等方面存在交互作用[27]，两者的主要连接点是激肽酶Ⅱ（ACE），抑制ACE可使缓激肽水平大为提升。除此之外，激肽释放酶与肾素产生部位的邻近，B2受体激动剂刺激肾素从大鼠肾小球内释放[28]，以及B2受体敲除小鼠中肾素mRNA水平的下降等[29]，这些都表明KKS和RAS在许多不同环节紧密相扣。ACEI尚可提高B2受体活性，同时激肽释放酶可能也表现为肾素原激活酶的作用[30]。AT1受体与B2受体均是G蛋白耦联的7次跨膜受体，它们之间能形成异源二聚体，激活Gαq和Gαi的能力加强，从而进一步放大这两个受体介导的信号传导。另外，AT1受体与B2受体在基因水平也存在一定的联系[31]。

除KKS与RAS间存在复杂的相互调节外，激肽也可以调节其他血管活性因子的表达和/或释放。研究显示，缓激肽可以增强肾小球毛细血管内皮素（ET-1）mRNA的表达[32]；刺激ADH的释放和PGE₂及PGI₂的产生[33]；在内皮细胞，B2受体可以与eNOS形成复合体而抑制其活性[34]。

三、KKS在疾病中的作用

（一）高血压

尽管许多年前就发现注射激肽可通过降低外周血管阻力而大幅度降低血压，KKS在原发性和继发性高血压中的作用仍有待进一步研究。在高血压患者及大鼠模型中均观察到激肽释放酶活性的降低。尿激肽释放酶水平和血压成反比。原发性高血压者尿激肽释放酶排泄降低[35]，盐敏感的患者比盐不敏感的患者水平更低[36]，尿激肽释放酶水平低下的儿童可能具有较高的高血压遗传背景[37]。激肽释放酶基因家族和ACE基因多态性均可能与自发性高血压大鼠的高血压有关[38,39]。这些发现表明KKS在对抗高血压中可能起到一定的保护作用。在盐敏感的高血压大鼠中，ACEI较ARB更好的减轻蛋白尿和肾小球硬化，从而提示增强的激肽活性可能在其中起到一定的作用[40]。

KKS的基因突变同样与人类和动物模型的高血压存在一定的相关性。自发性高血压大鼠的激肽释放酶基因突变失活[41]；在非裔美国人[42]和中国汉族人群[43]中也发现KLK1调节区基因突变与高血压之间的联系，其中常见的导致功能缺失的基因多态性表现为R53H基因突变[44]，而SNP却未发现对血压有较大的影响作用[45]。

KKS受体异常也可能导致高血压。整体动物模型中，激肽通过B1受体活化eNOS而引起LPS早期降血压反应。B1受体基因敲除小鼠缺乏LPS引起的降压反应，与其eNOS活性水平被显著降低有关[46]。在两肾一夹动物模型中，B2受体缺陷的小鼠高血压发病率较野生型小鼠高[47]。B1和B2受体的SNP也被证明与高血压[48,49]和高血压个体的心血管风险[50]相关。

（二）糖尿病肾病

无论是在动物模型抑或人类，均观察到KKS可能参与了糖尿病肾病的病理生理过程。在链脲霉素所致的糖尿病大鼠模型中，当血糖轻中度升高时，可观察到肾脏及尿液中活性激肽释放酶水平提升，且伴有GFR和RBF的增高以及肾血管阻力的下降[51]。抑肽酶和B2受体拮抗剂则可减少GFR及RBF，但滤过分数（FF）没有改变，而肾血管阻力显著增加，表明内源性肾脏KKS可能通过舒张入球小动脉调节肾小球血流动力学[52]。相反的，在未接受胰岛素治疗的糖尿病大鼠中，其高血糖和低滤过率明显，同时激肽释放酶的分泌和表达也相应减少[53]。

除血流动力学效应外，KKS在糖尿病肾病中亦可能通过其抗炎和抗细胞增殖的作用而起到对肾脏的保护，其机制在本节第二部分略有提及。此外，ACEI可防止糖尿病所致的肾脏细胞肥大，而B2受体拮抗剂则显著促进了肾脏细胞肥大，并消除了ACEI的作用，这也从另一个侧面提示肾脏细胞增殖肥大可能部分与KKS有关[54]。

激肽受体在糖尿病肾病中的作用尚存在一定的争议。同上所述，许多研究表明B2受体拮抗剂可减弱ACEI的作用。例如，在缺乏B2受体的糖尿病小鼠中观察到系膜细胞硬化增多和蛋白尿的恶化，考虑可能与氧化应激和线粒体损伤相关[55]。但Allen等人曾发现，使用B2受体拮抗剂不改变肾小球结构和蛋白尿，也未发现对ACEI的影响[56]。对受体的基因研究结果也未达成一致，有研究提示B2受体多态性与1型及2型糖尿病患者的蛋白尿具有相关性[57]，而其他研究则表明B1和B2受体与2型糖尿病患者均未发现相关性[58]。

（三）缺血性肾损伤

肾脏KKS的活性产物与血流动力学和肾小管水电解质排泄密切相关，因此可能影响缺血性肾损伤的预后。对缺血后肾脏激肽释放酶mRNA表达的动态观察发现，随肾缺血-再灌注其mRNA水平进行性上升，于4小时达高峰，而后逐渐下降，约1周时恢复正常。缺血-再灌注损伤模型中，ACEI在保护肾小管坏死和内皮功能等方面的作用要优于ARB[59]，这可能是由于ACEI增强了激肽的活性，同时有赖于B2受体和NO的协同作用而减轻氧化应激损伤[60,61]。单纯B2受体或B1和B2受体均缺陷的小鼠缺血损伤较野生型小鼠加重[62]。但是，外源性注射组织型激肽释放酶却可以加重大鼠肾脏的缺血再灌注损伤[63]。由此可推断，生理水平的激肽可保护肾脏的缺血损伤，而过高水平则可能是有害的[7]。

（四）慢性肾脏病

在进展性肾脏病中，激肽释放酶重组腺病毒载体可延缓肾功能的减退[64]，这些作用可能是通过NO增加而下调TGF-β和细胞外基质（ECM）的产生所致。研究表明，在B2受体基因敲除小鼠或给予B2受体拮抗剂的小鼠中，单侧输尿管梗阻（UUO）介导的肾小管间质纤维化明显增加[65]。相反，UUO中B1受体表达增加，而B1受体拮抗剂的应用可较少巨噬细胞浸润和纤维化[66]。B1受体缺乏的UUO小鼠表现为炎症因子减少，尿蛋白排泄下降和纤维化减轻[67]。因此这些观察研究证明，B2受体有肾脏保护作用，而B1受体则可促进肾脏纤维化。在人体中也发现B1和B2受体的基因多态性与ESRD进程相关[68-70]。

（五）肾病综合征

在肾病综合征大鼠模型中，尿激肽释放酶水平明显降低，且与蛋白尿程度成反比，而ACE活性增强；当蛋白尿缓解时，尿激肽释放酶浓度趋于正常，提示肾脏KKS可能参与了蛋白尿的发生[71]。Hutchison等[72,73]在被动型Heymann肾炎中研究了肾脏KKS与蛋白尿的关系及ACEI的作用，结果表明ACEI治疗后，随白蛋白尿程度减轻，尿激肽释放酶浓度显著上升，而ARB却没有类似作用。这提示肾脏KKS活性降低可能与蛋白尿发生有关，ACEI减轻蛋白尿的部分机制可能与抑制激肽降解和增加激肽释放酶的分泌有关。

（六）狼疮性肾炎/抗肾小球基底膜病/ANCA相关性肾小球肾炎

最近一些研究发现KKS与狼疮性肾炎、抗肾小球基底膜病、ANCA相关性肾小球肾炎等疾病发病机理的关联。在易患抗肾小球基底膜病小鼠和野生型小鼠中使用基因芯片技术分析得到360个表达不同的基因转录，低表达基因中的20%与激肽释放酶基因家族有关[74]。B2受体拮抗剂可使易患病小鼠的蛋白尿增多，而缓激肽则能延缓疾病进展。在SLE和狼疮性肾炎的患者中也发现了KLK1和KLK3启动子的单核苷酸多态性（SNP）。KLKL1重组腺病毒载体可减轻狼疮易患小鼠的肾脏损伤[75]。

ANCA相关性血管炎中的肉芽肿性多血管炎可导致坏死性肾小球肾炎，其主要的抗原靶点为蛋白酶3（PR3）。孵化PR3和HMWK能产生一种被称为PR3-激肽的新型十三肽激肽，它可以直接与B1受体结合，也能激活B2受体[76]。这些发现表明在肉芽肿性多血管炎中，PR3能通过激肽释放酶非依赖途径激活激肽通路，从而进一步影响疾病的病理生理过程。

四、KKS相关的药物治疗

在现有的常用药物中，ACEI是提高KKS活性最有效的药物，且其多方面作用的发挥是独立于降压效果之外的。尚在研究中的血管活性肽酶抑制剂（vasopeptidase inhibitor，VPI）能够抑制降解激肽的ACE、NEP及内皮素转换酶等，从而稳定KKS活性，达到相似的获益效果[77]。ACEI存在胎儿致畸，非透析慢性肾脏病患者发生高钾血症等副作用，故理想的药物是在特异性增强KKS功能的同时又尽量不影响RAAS。

KKS特异性的拮抗剂和激动剂在不同的治疗目的中发挥各自不同的作用。KKS拮抗剂可用于急性致死性炎症状态，包括感染性休克、哮喘、急性胰腺炎等。但是鉴于KKS对维持肾血流和抑制氧化应激等方面的作用，不建议长期使用KKS拮抗剂。KKS特异性的激动剂则可长期安全使用，特异性缓激肽受体激动剂可能对RAAS影响较小，从而可避免ACEI的副作用，得到更广泛的应用。

（尤　莉　郝传明）

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第七节　花生四烯酸代谢产物

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是一种由20个碳原子和4个分子丙烯键构成的不饱和脂肪酸，故又称二十碳四烯酸（C20∶4），其代谢产物具有广泛的生物学效应。在人体内AA是通过肝脏将必需脂肪酸亚油酸（C18∶2）加长并去饱和而形成。在生物体内AA主要以磷脂的形式存在于细胞膜上，在磷脂酶A₂（PLA₂）、磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）的作用下分解成游离的AA。虽然游离的AA在正常生理状态下水平很低，但当细胞膜受到各种刺激时，AA便从细胞膜的磷脂池中释放出来，转变为有生物活性的代谢产物。目前知道至少有三种酶参与AA的代谢：包括环氧化酶（cyclooxygenase，COX）、脂氧化酶（lipoxygenase，LPO）和细胞色素P450单氧化酶（P-450），形成具有生物活性的二十碳衍生物。本节将主要就肾脏中AA的环氧化酶途径，从产物的生物合成、调节机制、受体后信号传递、生物活性以及在肾脏疾病中的作用等方面做介绍。

一、环氧化酶途径

环氧化酶途径是肾脏AA代谢最为重要的途径。环氧化酶是非甾体消炎药NSAIDs镇痛、退热和抗炎作用的主要治疗靶点[1,2]。花生四烯酸在环氧化酶的催化下产生前列腺素（prostaglandin，PG）等代谢产物[3]。

前列腺素是一族含有20个碳原子的不饱和脂肪酸，具有一个五碳环和两条侧链。PGs的合成分3步：受细胞因子和生长因子等因素刺激，细胞膜磷脂上的PLA2被活化，将膜磷脂水解释放出花生四烯酸；花生四烯酸经环氧化酶COX催化分两步转化为PGH₂:COX首先将花生四烯酸转化为不稳定的PGG₂，然后COX的过氧化物酶活性将PGG₂催化为PGH₂。随后PGH₂被不同的前列腺素合成酶催化代谢为更稳定的5种生物活性前列腺素，包括PGE₂、前列环素（prostacyclin，PGI₂）、PGF₂α、PGD₂和血栓素A2（TXA₂）[4-7]。

前列腺素的快速降解使其作用限制在合成部位附近，以自分泌或旁分泌的形式发挥作用。每种前列腺素作用于特异性的G蛋白偶联受体[8,9]或PPARδ和PPARγ等核受体[10-13]（图1-8-7-1）。

（一）环氧化酶（COX）

COX是AA代谢为前列腺素的限速酶，其分子中有两个催化位点，一个位点具有COX活性，可催化AA形成PGG₂，另一个位点具有过氧化物酶活性，催化PGG₂形成PGH₂。COX有两种亚型：COX1和COX2[14-17]，两者分子量均为71kDa，有600多个氨基酸，其中63%序列相同。人COX1基因约长22.5kb，由11个外显子和10个内含子构成，定位于第9号染色体9q32～33.3；而编码人COX2的基因长度为8.3kb，由10个外显子和9个内含子构成，定位于第1号染色体1q25.2～25.3。COX1的mRNA为2.8kb，COX2的mRNA约4.5kb。

COX1在正常组织和细胞中有稳定的基础表达，认为对维护胃黏膜细胞，控制血小板聚集等基本功能有重要作用[1,5,18]。而COX2是一种诱导酶，可被炎症介质和丝裂酶素诱导，在血管生成、炎症、肿瘤发生等病理生理过程中起重要作用[1,5,18,19]。然而最近研究提示COX2除了被诱导后的作用外，COX2在肾脏发育、排卵和分娩过程中有重要作用，而且对维持心血管内环境稳定起重要作用[20-26]。近来有研究提示当一个体细胞同时表达COX1和COX2能形成功能性异二聚体，COX2和COX1联合能促进COX1介导的前列腺素合成[27]。

COX1和COX2在组织中的表达部位不同。在肾脏，COX1主要表达在集合管，间质细胞、肾小球系膜细胞，小动脉内皮细胞也有低滴度的COX1表达[28-31]（图1-8-7-2）。COX2主要表达在肾脏髓质间质细胞和皮质升支粗段及致密斑细胞[15,28,32]（图1-8-7-2），许多生理应激可诱导COX2在这些细胞的表达。虽然COX2最先在内皮细胞被克隆，但是免疫组化和原位杂交法都未能在肾脏内皮细胞检测到明显的COX2表达。

（二）前列腺素合成酶

前列腺素合成酶包括PGE2合酶（PGES）、前列环素合酶（PGIS）、PGD合酶（PGDS）、PGFS和血栓素合酶，分别参与PGE₂、PGI₂、PGD₂、PGF₂和TXA₂的合成[18,33]。PGE合成酶有三种同工酶：膜结合型PGE合成酶1（mPGES1）、膜结合型PGE合成酶2（mPGES2）以及胞质型PGE合成酶1（cPGES1）[34-36]。mPGES1是可诱导型酶，主要与COX2偶联，介导生理状态下PGE₂的产生[34]，而cPGES和mPGES2则不易被诱导[7,36]。PGDS催化PGH₂合成PGD₂[37-38]，现已知两种不同类型的PGDS：促脂素型（lipocalin-type PGDS，LPGDS）和造血型PGDS（hematopoietic PGDS，H-PGDS）[38,39]。PGF₂由9，11环内过氧化物还原酶催化PGH₂合成[40]，也可由PGE9酮还原酶催化PGE₂合成[41,42]。

肾脏内前列腺素合成酶的分布不完全具有特征性。肾脏mPGES1主要表达在集合管[31,43,44]，以及髓襻升支粗段和致密斑[31]。在皮质和髓质的间质细胞可检测出低水平的mPGES1[31,43,44]。在肾脏中也能检测到低水平的mPGES2和cPGES[45,46]。PGIS主要位于肾脏血管系统[44]。RT-PCR提示L-PGDS主要表达在肾脏皮质和外髓[45,46]。而H-PGDS mRNA仅可在微切割的外髓集合管被检测到[44]，但其功能尚不清楚。

PGE₂是肾脏表达最多的前列腺素，其次是PGI₂、PGF₂、TXA₂[47,48]。在基础情况下COX1和COX2催化途径都参与这些前列腺素的生物合成，但在血管紧张素刺激时，PGE₂和PGI₂主要由COX2通路产生[47]。这些前列腺素的细胞合成部位尚不完全清楚。

（三）前列腺素受体

前列腺素释放后需通过与靶细胞上的前列腺素受体结合发挥作用。这些受体均为跨膜G蛋白耦联受体，包括DP、EP、FP、IP和TP受体，每个受体分别选择性的与PGD₂、PGE₂、PGF₂α、PGI₂以及TXA₂结合[8,9]。其中EP受体有四种亚型：EP1、EP2、EP3和EP4[8,9]。TP受体是血小板聚集和平滑肌收缩的有效激活剂，而IP受体具有抗凝血功能。EP1和EP3是平滑肌收缩剂，EP2、EP4及IP受体可松弛包括血管平滑肌在内的平滑肌。有报道EP1可介导痛知觉[49]，EP3对致热源反应起重要作用，EP4缺陷导致动脉导管未闭。

这些前列腺素受体表达于不同的细胞，与特异的前列腺素结合并介导相应的信号通路。每种前列腺素激活相应的G蛋白偶联信号通路。IP、DP、EP2和EP4受体通过激活偶联刺激性G蛋白（Gs）增加细胞内cAMP水平；而TP、FP和EP1受体则（至少在一些组织）可诱导钙动员[8,9]。EP3受体与抑制性G蛋白（Gi）偶联减少cAMP合成[8,9]。虽然一些受体使用相同的第二信号通路，但每种受体激活的第二信号通路下游靶目标不同，从而表现为不同的生理效应。每种前列腺素受体发挥不同效应的信号传导机制仍未完全阐明。

前列腺素受体在肾脏表达的部位及其作用各不相同[50]。如PGE₂对入球小动脉有双向调节：EP1和EP3介导收缩作用，EP2和EP4介导扩张作用。虽然有功能性证据表明EP1受体存在于微血管，但EP1 mRNA主要在集合管表达[51]。激活EP1受体可增加细胞内钙浓度，抑制微灌注的集合管水钠重吸收[51]，提示EP1受体可能存在利钠利尿作用。EP1敲除小鼠没有表现为排钠排水功能受损[49,52]，但这种小鼠的血压较低，血浆肾素增加[49]，近期更多研究提示EP1受体主要促进血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的血管收缩。在EP1敲除小鼠中AngⅡ加压作用受损可能引起低血压[53]。虽然EP1敲除小鼠使血管升压素（AVP）释放改变，但其肾脏浓缩稀释功能与野生型小鼠类似[52]。在体外灌注集合管和小鼠体内功能效应研究的不一致结果可能是EP1缺陷的系统性血管效应掩盖了EP1阻断的肾脏效应，或体内研究因EP1敲除引起的代偿反应。

EP3 mRNA在升支粗段和集合管表达[54]。COX抑制剂吲哚美辛（indomethacin）可增加野生型小鼠的尿渗透压，但不能增加EP3敲除小鼠尿渗透压，然而野生型小鼠EP3敲除与AVP作用相比并不能显著影响尿液浓缩功能[55]。FP与EP3在主要氨基酸序列上有最高的同源性，并在远端肾小管和皮质集合管高表达，从而抑制肾脏水盐重吸收作用[56,57]。FP mRNA主要表达在表浅集合管，EP3在深层皮质和外髓集合管，EP1位于内髓集合管。沿集合管轴的这些依序表达（图1-8-7-3）提示功能重叠，解释不同受体敲除模型和肾脏盐转运表现。

虽然肾脏中只能检出极低水平的EP2 mRNA，且其精确的表达部位尚不清楚，但EP2敲除小鼠呈现盐敏感性高血压，提示这一受体对盐排泄的重要作用[58,59]。EP4 mRNA主要在肾小球表达，可能作用于肾小球血流动力学的调节[9,60]。IP mRNA表达于入球小动脉，扩张肾小动脉刺激肾素释放[9]。TP也表达于肾小球，与TXA₂对肾小球毛细血管有效收缩作用相符合，GFR减少可能抵消这些扩张性前列腺素的作用，增加肾小球阻力。目前没有关于DP在肾脏表达的证据[9]。

二、COX及前列腺素在肾脏生理及病理生理中的作用

（一）对肾脏血流动力学的作用

前列腺素在调节肾血流量（renal blood flow，RBF）和GFR方面具有重要作用[61,62]。正常情况下前列腺素似乎很少影响RBF和GFR[61]，但在特定的病理生理状态，特别是有效循环血容量减少时，如充血性心力衰竭，肝硬化腹水，肾病综合征等，正常肾功能的维持依赖于前列腺素[62-65]。COX抑制剂NSAIDs可引起这些患者GFR的急剧下降[62-65]。

随着COX2的发现，曾认为前列腺素“管家”作用主要是来源于COX1通路，并希望选择性抑制COX2不会像非选择性COX抑制剂对肾血流动力学造成影响。然而临床研究证实选择性COX2抑制剂在生理应激（如失盐）的志愿者显著减少GFR和RBF[66-68]。COX2来源的前列腺素在维持肾功能方面的作用也得到了动物实验的支持[30,69]。低容量时，儿茶酚胺、血管紧张素和血管升压素释放增加将收缩肾动脉和外周动脉[70-72]。这些缩血管效应可被肾内血管扩张剂（包括前列腺素）的对抗，从而保护肾血流量[73,74]。

内源性PGEs通过扩张入球小动脉对维持GFR起重要作用[75,76]。最近研究提示前列腺素主要表达在致密斑[28]。当人类和啮齿类动物容量丢失时，致密斑和皮质髓袢升支粗段COX2表达显著增加[28,77]。有报道PGE₂是皮质升支粗段和致密斑合成的主要产物，其释放增加能减少小管腔氯化物排出[78]。COX2和mPGES1在致密斑的共表达进一步支持PGE₂在肾单位这些节段起到调节COX2的重要作用。PGI₂是否也在致密斑合成尚不清楚，一些研究发现PGIS在致密斑和皮质升支粗段表达[79]，另一些研究则相反[44]。下游前列腺素受体调节入球小动脉血管扩张作用尚未完全阐明，可能的有效调节受体包括：EP4、EP2和IP受体[50,80]。最近研究发现EP4和EP2受体激动剂对氯化汞急性肾损伤动物模型可改善肾功能和/或增加存活率，支持EP2/4对肾功能的保护作用[81]。PGI₂在维持肾血流量方面的作用已被证实，PGIS敲除与缺血性肾损伤相关[82]。但是IP受体缺陷并不引起与PGIS缺陷相同的肾脏损伤[83]，提示有其他信号机制参与PGIS对肾血流量的有效作用。

除了前列腺素对肾前小动脉直接的血管扩张作用，增加致密斑合成前列腺素也增加了肾素的释放[83]（图1-8-7-4），肾素将血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ，增加血管紧张素Ⅱ水平。血管紧张素Ⅱ对肾小球出球小动脉的收缩大于对入球小动脉的收缩[84,85]，从而增加了肾小球内压，维持容量缺失条件下肾小球滤过率。这一AngⅡ优先作用于出球小动脉的效应被PGE₂优先扩张入球小动脉的作用进一步加强[75]。

（二）对血压的调节作用

前列腺素在调节血压方面起到重要作用[86,87]。使用NSAID抑制内源性前列腺素合成可能导致系统性高血压或使已存在盐敏感性高血压个体的血压难于控制[88,89]。近期的临床研究（包括CLASS，VIGOR，TARGET和APPROVE研究）一致提示选择性COX2抑制剂也与高血压相关[24,26,91-94]。COX2抑制剂引起高血压的机制可能是多因素的。给患者服用选择性COX2抑制剂或非选择性COX抑制剂常引起钠潴留和水肿[26]，提示COX2衍生前列腺素在正常情况下参与促进肾脏钠的排泄，从而维持正常血压，抑制COX2影响了尿钠排泄导致钠潴留。

近年研究发现肾脏髓质间质细胞前列腺素在调节钠平衡和维持血压方面起重要作用（图1-8-7-5）。高盐饮食增加了肾髓质COX2和mPGES1的表达[29,95]。对高盐饮食的小鼠选择性肾内髓灌注COX2或COX1抑制剂可引起高血压[25,96]。而高盐饮食主要诱导肾髓质间质细胞COX2表达，推测间质细胞合成的前列腺素可能通过旁分泌作用，增加肾髓质血流或/和抑制小管钠重吸收。COX2抑制剂可减少肾髓质血流量[97]，肾髓质血流量减少将引起钠潴留并发展为高血压[98]。因mPGES1在集合管高表达，集合管也是COX1主要表达的部位，所以高盐饮食诱导mPGES1表达可能伴随着COX1表达，从而引起集合管PGE₂合成增加。阻断COX1可能通过抑制高盐诱导PGE₂合成，阻止PGE₂促进集合管尿钠排泄作用[51]，从而引起盐敏感性高血压[96]。同样高盐饮食后mPGES1敲除小鼠也发展为高血压，进一步证实PGE₂介导COX抗高血压的重要作用[95,99]。高盐饮食也增加PGF2α合成[100]，但其具体作用尚不确定。IP受体基因敲除也与盐敏感性高血压有关，支持COX衍生PGI₂在维持盐平衡和血压方面的重要作用。

哪种COX衍生前列腺素调节钠平衡和维持血压的机制正在被逐渐阐明。EP2，EP4或IP受体似乎通过扩张直小血管控制肾髓质血流量[50,70]。EP2和IP2受体在调节钠平衡和血压稳定的重要作用被很多研究证实，提示EP2或IP受体缺乏与盐敏感性高血压相关[50,92]。EP1和EP3受体可能介导抑制髓襻升支粗段和集合管对盐和水的重吸收[93]。但是，将EP1和EP3基因敲除的研究提示即使在高盐饮食下也没有引起盐潴留或高血压[49,50,53]。

与肾髓质COX2表达不同，饮食氯化钠摄入减少增加肾皮质COX2表达。大量研究显示，肾脏皮质COX2的产物是介导肾脏肾素合成释放的重要机制（图1-8-7-5）。早在20世纪80年代就证实使用吲哚美辛治疗缺盐老鼠将减少血浆肾素活性并导致血压下降[101-107]。随后的研究提示几乎所有诱导肾素释放的行为都增加致密斑、皮质升支粗段COX2的表达，如低盐饮食、使用利尿剂、ACEI[108]。高肾素水平的人体也伴有致密斑COX2表达增加[77]。大量体外或离体研究证实PGE₂和PGI₂能通过EP4，EP2或IP受体[72,83,109]刺激球旁器释放肾素。COX2抑制剂或敲除COX2基因显著减少低盐饮食对血浆肾素水平的刺激。COX2衍生的前列腺素能够刺激肾素释放。COX2在容量丢失条件下介导肾素释放被认为是在加强肾脏钠重吸收和维持血压方面起重要作用。在这些条件下COX2抑制剂实际上能降低而不是增加血压[106,107]。

前列腺素也可通过释放肾素在肾血管性高血压的发病机制中起重要作用。肾动脉狭窄的动物和人服用NSAIDS都将降低血压[90,110]。动物研究提示大动脉狭窄增加致密斑/皮质升支粗段COX2的表达[111]。COX2抑制剂也能减少肾素活性，在肾血管性高血压动物模型中降低血压[111]。这些研究提示致密斑处COX2催化产生的前列腺素在肾血管性高血压中参与了肾素的合成和释放。虽然体外及离体研究都令人信服的证实EP2，EP4，IP受体能诱导肾素释放，体内研究显示只有破坏IP受体基因能够减弱双肾一钳夹小鼠模型高血压的进展，并伴随血浆肾素活性的减少[112]。相反有证据表明使用襻利尿剂呋塞米利钠排泄后的小鼠，EP4受体基因敲除将抑制其肾素表达[113]。因此前列腺素受体在肾脏调节肾素的精确作用仍有待研究。

（三）对肾髓质细胞的作用

长期使用COX抑制剂NSAIDS会引起肾乳头坏死[114,115]。位于肾髓质的细胞，特别是肾乳头的细胞，正常情况下有强大的耐受渗透压和低氧压力的能力。动物研究提示脱水情况下肾髓质间质细胞COX2 mRNA和蛋白表达显著增加[105,116]，这时使用选择性COX2抑制剂阻断COX2活性导致髓质间质细胞凋亡[105]。提示肾脏髓质COX2产物对维持髓质细胞的存活有重要意义。这是为什么在脱水的情况下，更容易发生NSAIDS相关性肾乳头损伤[76,114]。此外，COX2衍生前列腺素对肾髓质间质细胞的作用可能在于维持肾髓质血流[98,117]。肾髓质间质细胞直接与直小血管相邻[118]，支持这些细胞或来源于细胞的COX2产物在维持肾髓质血流时起重要作用。维持一定的血流对肾脏髓质细胞的存活也有一定意义。

（四）对肾脏发育的作用

前列腺素是肾脏发育的必要因素[119,120]，有报道指出妊娠末三个月服用NSAIDs的妇女会导致新生儿肾脏发育不良和羊水过少。这在小鼠基因靶向研究中得到了进一步的证实：靶向破坏COX2基因导致肾脏发育障碍，以肾小球发育不全及构成皮质包膜的囊下小管缺失为特征[119,120]。肾发育所需要COX2活性细胞定位尚不清楚，COX2促进肾发生的机制也不清楚。在发育中的肾脏中，COX2主要表达在毗邻新生小球的发育的小管上皮细胞以及逗号型、s型特定数量的细胞，这些将发育构成致密斑[22,121]。然而另外一些研究提示在肾发生过程中COX2免疫反应蛋白表达在间充质细胞基质[121]。因此COX2衍生前列腺素作用于肾发生的细胞来源仍不清楚。

（张　敏　郝传明）

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