第二节 纳豆激酶
一、纳豆激酶的实验室研究
继须见博士轰动世界的“下午两点半实验”之后，全世界范围内掀起了纳豆激酶研究的热潮。特别是近30年来，纳豆激酶的发现，纳豆激酶单位的设定，纳豆菌生物提取酶、维生素以及抗菌成分的研究，不断有新成果被发现和证实。由于纳豆激酶显著的医疗保健作用，公众给予纳豆菌的关注与日俱增，研究逐步深入。
1992年，Nakamura等测定了纳豆激酶的基因序列。它的全长基因包括调控序列在内共1473个碱基对，起始密码子上游17′处为核糖体结合位点AAAGGAG, SD序列上游为A/T含量高达70%的转录调控区，1143个碱基对阅读框架编码29个氨基酸的信号肽、77个氨基酸的前肽及275个氨基酸的成熟肽。前肽在蛋白质的分泌与折叠过程中起着重要的作用。在大肠杆菌中表达成熟肽的报道很多，表达量约占细菌总蛋白的30%。但大多表达产物都以包涵体的形式存在，而且很难复性。有文献[16]报道，纳豆激酶可在大肠杆菌中以融合蛋白方式表达，表达蛋白占菌体蛋白的15.2%。而蛋白表达方式的不同，其原因在于应用的表达载体不同。当选用pRIT2T（Protein A融合型）为载体，受体菌为大肠杆菌N4830时，产物以融合蛋白形式表达，而使用pBV 220为载体，以大肠杆菌DH5a为受体菌，则表达产物是以包涵体形式存在。1993年，Fujita对纳豆激酶进行表达，其相对分子质量为277 000，为具有丝氨酸蛋白酶特征的蛋白水解酶。[17]
从20世纪90年代起，我国科技人员在菌种选育及菌种的生理生化特性鉴定、纳豆激酶的分离提纯及其氨基酸顺序、基因序列测定、理化性质研究、体内外溶栓试验、急性毒性试验、治疗脑梗死的初步临床研究等方面进行了大量试验工作。
黑龙江刘宇峰等人已进行了纳豆激酶制剂的生产中试研究，其产品酶活力可达30 000FU/g，但这一结果并不是用世界通用的最权威的溶血栓测定方法检测所得。由于纳豆激酶稳定性差、提纯困难，得率低，且纳豆激酶的活力都比较低等原因，国内至今没有将纳豆激酶开发成为溶栓药物的报道，市场上销售的纳豆激酶保健品较多。[18]黄占旺等人针对纳豆菌生物学特性，研究了不同温度、pH、培养时间、通气量、接种量、盐浓度因素对纳豆菌生长的影响，试验结果表明，该菌种生长适宜条件为：温度30～45℃；通风，转速140 r/min（500mL三角瓶装液量100mL）；pH 7.0；培养时间24h；接种量2%～5%。纳豆菌耐盐性较强，在含盐量8%的条件下仍能较好生长。[19]朱健辉等人通过用纳豆杆菌进行液态发酵生产纳豆激酶的培养基的优化实验，确定最佳产酶培养基组成为麦芽糖2%、酵母膏4%、CaCl20.03%，pH 7.0。在此基础上，设计发酵条件的优化实验，结果表明，在接种量为1%，装液量为100mL/500mL挡板瓶，200 r/min的条件下，34℃培养48h达到产酶高峰，产酶活力可达4300 U/mL发酵液。在此基础上，通过模型来描述纳豆激酶的生成，确定纳豆激酶的液态发酵属于部分生长偶联型，这是已见报道的最高酶活记录。[20]利用筛选的纳豆菌试制饮料、咀嚼片、胶囊等相关保健品的研究也见报道，其中刘新梅等人利用纳豆菌发酵酸豆乳，当发酵时间为79h，温度为28℃，装液量为23mL，酶活可达800.15FU/mL。[21]但是目前相关研究还没有真正地对筛选的纳豆菌种进行比较全面的鉴定分析，部分菌种鉴定实验也只是粗浅地集中在常规的菌种个体形态、菌落形态、生理生化反应等领域，对于纳豆菌的种属地位、与其他菌种的亲缘关系及在微生物系统发育学上的地位问题缺少充足的有说服力的直接证据。
一般从豆豉中筛选出的水解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amylolique fsciens）和从自然界中筛选出来的地衣芽孢杆菌B.LPY菌株[22]都可以作为生产纳豆激酶的菌种。此外，在中国南方的药酒中筛选出的根霉（Rhizopus chiensis）12#经过仔细研究后，发现也具有一定的纤溶活性，[23]但是现在通常使用的用于生产纳豆激酶的菌种还是从纳豆中筛选出的纳豆杆菌。
除上述研究成果，以下是部分关于纳豆激酶的研究和报道。
1993年MitsuguFUjita等人报道，相比纤溶酶而言，纳豆激酶更应属于一种具有纤溶活性的枯草蛋白酶。不仅因为纳豆激酶的序列与枯草蛋白酶有很高的同源性（与枯草杆菌蛋白酶E的同源性高达99.5%，与枯草蛋白酶A的同源性达99.3%），而且其最敏感的底物也就是枯草蛋白酶的底物（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA）。通过对该酶抑制剂的研究发现，丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）几乎可完全抑制它的纤溶和酰胺水解活性。而其他丝氨酸蛋白酶抑制剂对它的纤溶活性没有影响，对酰胺水解活性的影响也非常小。
2002年广东双骏生物科技有限公司，优化出稳定高产的纳豆激酶菌株，并开发出纳豆激酶食品及其组合物，而且还在纳豆菌发酵液中提取出维生素K2、多聚谷氨酸等活性分子，并发布了纳豆激酶琼脂糖-纤维蛋白平板法、分光光度法、液相色谱法、NKIU法等纳豆激酶含量与活性的测定方法。
2003年4月11日，《人民日报》（第七版）报道纳豆（类似我国的豆豉）菌分泌的纳豆激酶有抑制血小板聚集的作用，有助于预防高血压和动脉硬化。随后中央电视台及其各地方电视台开始普及纳豆知识。
2004年，欧洲的研究小组报告纳豆激酶具有预防旅客血栓症，即所谓经济舱综合征的功效。旅客血栓症是乘坐飞机等旅行时，长时间坐在座位上，血液循环受阻、血液黏度上升，导致静脉血管出现血栓的病症。
2004年内蒙古农业大学的多位教授研究发现，纳豆激酶对凝血的三个阶段都有影响，且与肝素相比，作用缓和，不易引起出血。
2005、2006年连续两年内超过800万美国人服用纳豆激酶功能食品，用来预防中风、心肌梗死、脑梗死。
2007年，世界卫生组织最新统计结果表明：在2005—2007年之间，纳豆激酶为全世界9000多万名中风、偏瘫、心梗、脑梗死患者提供90%以上治愈率，纳豆激酶已经成为目前世界性防治血栓疾病的首选成分。
目前已有诸多学者进行了纳豆激酶蛋白质性质的研究。得知纳豆激酶相对分子质量为27 728，pI为8.6±0.3。Sumi等人首次报道，[1]并认为它是一种纤溶酶类丝氨酸蛋白酶，能有效地水解纤维蛋白。因此，纳豆激酶是一种具有纤溶酶活性的枯草蛋白酶。
2008年河南省微生物工程重点实验室通过对纳豆激酶酶学性质的研究发现，纳豆激酶在40℃以下纤溶活性较稳定，65℃以上活性迅速下降。
2008年江南大学国家大学科技园的多位教授完成了固体发酵纳豆激酶培养基的优化。
2009年沈阳药科大学生理教研室开始研究纳豆激酶的溶栓活性、抗凝血活性、纳豆激酶与阿司匹林、华法林、尿激酶、蚓激酶等相关药物的相互作用及其对代谢综合征的影响。
2011年广州市微生物研究所完成了纳豆激酶分离纯化的工艺优化。
2013年天津科技大学和唐山师范学院完成了对纳豆芽孢杆菌的分子鉴定以及对纳豆激酶的基因克隆。
2013年浙江省宁波市李惠利医院的胡静建立了快速、简单测定纳豆激酶活性的方法。
2014年Xuetuan Wei所在实验室将纳豆激酶与纳米银组合在一起，发现此组合棒具有溶解纤维蛋白和抗菌的双重作用。
我国研究人员从日本的纳豆激酶研究得到启发，逐渐把研究方向转向我国传统的大豆发酵食品，从豆豉中分离具有纤溶活性的酶，并初步测定了其相对分子质量为3600。[24]豆豉纤溶酶在体内有很好的溶栓活性，在体外也具有很强的抗凝血能力。[25]通过对自行筛选的分解淀粉芽孢杆菌DC-24豆豉溶栓酶的N-端序列的测定以及同源性分析表明，豆豉溶栓酶成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为80.0%和86.5%，这从分子角度证明了豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶。[26]由于纳豆激酶来源于食品，并且口服有效，非常有希望成为新型有效的溶栓药物。[27，28]
二、纳豆激酶的生物活性
1987年日本富崎医科大学须见洋行等首先发现纳豆激酶，随之将提取出的纳豆激酶应用于狗的血栓溶解实验，证明纳豆激酶是一种有纤溶活性的酶制剂，所以定名为纳豆激酶。1995年Fujita在血栓模型上测试纳豆激酶对栓塞后血流再通的作用，发现它的活性是相等剂量纤溶酶的4～5倍。[29]
纳豆激酶可显著延长凝血时间，沈阳药科大学王建教授和吴浩博士采用分子对接的方法研究发现，纳豆激酶可与凝血因子 Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅺ，Ⅹ Ⅲ发生结合（图1-19～1-25）。2009年Hsia等人给健康志愿者服用纳豆激酶胶囊200mg/天，服用2个月后测定凝血因子水平，发现服用纳豆激酶使纤维蛋白原，凝血因子Ⅶ、Ⅷ含量显著降低，但不影响血脂水平。[30]
图1-19 纳豆激酶与 Ⅱ因子的结合
图1-20 纳豆激酶与 Ⅲ因子的结合
图1-21 纳豆激酶与 Ⅴ因子的结合
图1-22 纳豆激酶与Ⅶ因子的结合
图1-23 纳豆激酶与Ⅸ因子的结合
图1-24 纳豆激酶与Ⅺ因子的结合
图1-25 纳豆激酶与Ⅹ Ⅲ因子的结合
纳豆激酶可显著抑制血栓素TXB2水平，提示其可能通过抑制环氧化酶，抑制TXB2的形成，产生阿司匹林样作用。
采用56只新西兰兔，随机分为7组：溶剂对照组、模型组、纳豆激酶（粗）灌胃组、纳豆激酶（精）灌胃组、纳豆激酶（精）注射组、硫酸氯吡格雷组、硫酸氯吡格雷与阿司匹林组。用球囊导管自股动脉插管建立家兔主动脉球囊损伤模型，检测各组血小板数目及聚集情况、腹主动脉组织病理学改变，并采用免疫组化法对MMP-2、9表达情况进行检测。结果与模型组相比，3个纳豆激酶给药组血小板数目及聚集情况均无明显改变（p＞0.05）；狭窄指数均显著提高，内膜增殖指数均降低（p＜0.05）；MMP-2、9表达均无明显改变。结论：纳豆激酶可抑制血管成形术后再狭窄，但并非通过作用于血小板和影响MMP-2、9表达发挥作用。
纳豆激酶对血小板聚集和血栓形成的影响，与阿司匹林进行对比，用兔的富血小板血浆孵育纳豆、胶原蛋白和凝血酶，通过测定血小板聚集率进行分析。结果，纳豆激酶显著抑制胶原和凝血酶诱导的血小板聚集。纳豆激酶减少血栓素B2形成，并以浓度依赖性方式抑制胶原蛋白活化的血小板。鼠经口给纳豆1周，用35%三氯化铁滤纸处理动脉10min，观察纳豆对三氯化铁诱导的动脉血栓的影响。通过激光多普勒探头监测血流量发现，纳豆激酶延迟三氯化铁诱导的动脉闭塞，500mg/kg的纳豆充分防止了血栓阻塞，从而延缓血栓形成。2013年Jiang等人通过体内、体外实验证明，160～500mg/kg纳豆激酶服用1周，抑制血小板聚集可达到40%，通过抑制血小板聚集和溶栓作用，实现对血液循环的调解，从而抑制心血管疾病的发生。[31]
2011年Fujita在测试纳豆激酶对血压的影响，发现在大鼠的食物中加入纳豆激酶，使收缩压和舒张压均明显下降。[32]2008年Kim进行纳豆激酶降压作用的临床研究，发现纳豆激酶使高血压患者的收缩压和舒张压均明显下降。[33]其实，纳豆激酶作为保健食品投入使用，已使数以万计的高血压患者血压下降。
纳豆激酶除上述功能外还具有护肤、健脑、提高记忆力、减肥等保健功能。纳豆菌产生的吡啶二羟酸结合金属的能力很强，能够清除体内的放射性元素，常吃纳豆可减少患白血病的概率。纳豆在发酵过程中产生的菌丝黏液物质，其成分为类果聚糖的混合物：果糖和γ-多聚谷氨酸，它覆在黏膜的表层上，可保护肠胃，防止醉酒。有些研究还认为，大豆制品中的某些蛋白质可促进甲状腺激素分泌，从而促进糖和脂肪的分解代谢，提高和保持精力。
有研究表明，口服纳豆激酶能明显降低深静脉血栓和肢体水肿的发生。吴杰忱等报道了纳豆激酶在骨质疏松和糖尿病的预防和治疗中的作用。
随着生活水平的提高，人类寿命逐渐延长，血栓类疾病的发病率也有逐年上升的趋势。世界心脏学会联合公布最新统计资料显示，由心脑血管疾病引起的死亡已经跃居各类疾病之首。我国有13亿人口，随着人口的老龄化和人们保健意识的增强，纳豆中的活性成分纳豆激酶作为新一代的溶栓剂或保健食品，具有极为诱人的广阔前景。
国内外在抗血栓药物方面的研究正趋向于低价高效、易吸收、体内半衰期长的药物方向发展。纳豆激酶来源于传统发酵食品，生产工艺简单，安全性高，符合治疗血栓病的药品或食品基料的要求。由于纳豆有一股特殊的氨臭味，不易被人们接受，这也致使纳豆的发展受到一定程度的限制。对纳豆中特殊氨臭味的处理成为研究的热点，可以将纳豆与我国传统食物的风味结合起来，通过调整产品的形态、添加风味物质、低温干燥等处理方法，去除其特殊的味道，同时又保留原有的功能特性和营养价值，满足不同人群的需求。而通过分子筛从纳豆提取物中分离纳豆激酶时，胺类物质就已进入尾料中，所以纳豆激酶没有纳豆那种特殊的味道。
2006年Kazuya等进行纳豆激酶双盲对照的二期临床研究，[34]2008年Ninomiya与华法林对照进行纳豆激酶的临床评价，[35，36]以及Lampe在2016年对纳豆激酶的毒理研究所进行的总结，[37]证明纳豆激酶应用安全有效。[38]
三、纳豆激酶产品的国内外市场开发
鉴于纳豆激酶的神奇功能，国内外很多学者和公司对纳豆食品和含纳豆激酶的保健食品和药品进行了深入开发。
目前，广东双骏生物科技有限公司采用（液体）发酵法生产纳豆激酶，产量高且采用膜集成化的全物理分级浓缩的工艺，产品已在国内外市场广泛应用。黑龙江省科学院应用微生物研究所已筛选出纳豆激酶高产菌株，探索出液体发酵生产纳豆激酶以及分离提取纳豆激酶的生产工艺。同时，上海医科大学分子遗传室已经克隆了纳豆激酶基因，完成了DNA测序，并获得了纳豆激酶的基因工程菌，表达量可达40%以上，建立了用工程菌生产纳豆激酶的纯化工艺。
已投放市场的纳豆激酶产品有：北京燕京中发公司的燕京牌纳豆、北京龙兴的纳豆激酶胶囊、天津百德公司的纳豆口嚼片、湖南贵生坊的纳豆素胶囊、草仙药业的净血酶纳豆胶囊、天津宝恒生物的蛋白硒纳豆胶囊和广东双骏生物科技有限公司的纳豆激酶红曲胶囊等。
日本拥有400多家公司生产纳豆和纳豆激酶产品以满足国内外需求。近年来纳豆激酶作为食品添加剂、功能性食品和普通食品发展十分迅速。
（1）日本大和制药有限公司
其产品名称为“纳豆激酶CP”（纳豆激酶复合产品）。其产品的生产条件符合GMP要求，也具有严格的质量控制标准。酶活性测定采用酶解底物法，即用纤溶酶分解的4肽底物S22511，依据在405 nm波长的吸收值计算的方法，简单且准确。
该公司纳豆激酶既有生产原料也有生产制剂，制剂有硬胶囊、软胶囊和片剂三种剂型。作为功能食品，该公司供应的原料在国外的代销机构制成单一制剂或添加其他成分（如SOD、DHA、VE、卵磷脂、银杏提取物等）制成复方制剂。如，肠溶胶囊，每粒含325mg纳豆激酶提取物，日口服1～3次，每次2粒，预防心脑血栓最宜在睡觉前服用。其售价在每90粒40～50美元。
（2）温翠普-圣特公司
该公司生产的“纳豆精”，是从纳豆中提取出的纳豆精华，即纳豆激酶，制剂有软胶囊和硬胶囊两种。它的产品作为食品添加剂和功能食品在日本和世界各地销售。胶囊规格为100mg/粒，相当1000单位，每天服用2～3粒。“纳豆精”具有较好的预防由动脉血栓引起的冠心病、中风等症的作用，同时具有降血脂、降血黏、降血压、降胆固醇、溶解视网膜静脉血栓的作用和抑菌、抗氧化等作用。
（3）过敏症研究集团公司
该公司生产的纳豆激酶复方制剂，90粒胶囊/盒，销售价为65美元，作为食品补剂和功能食品在国内外销售。每2粒含纳豆激酶275mg，其他成分包括豆油、大豆卵磷脂、甘油脂肪酸乙酯、芹菜籽油、蜂蜡等。作为食品补充剂和功能食品，早晨、中午各服1粒；晚睡前服2粒可用于预防和治疗血栓性疾病。
（4）真保健公司
该公司推出的“云香苷酶”的复合制剂（肠衣片）内含纳豆激酶（500FU/片）、菠萝蛋白酶（100mg/片）和云香苷生物黄酮类化合物（120mg/片）等。主要功能是调节体内免疫系统的平衡并具有抗炎活性，降解由于随年龄增长体内所累积的蛋白质，改善血液循环以预防心、脑血管疾病。
（5）生物技术研发公司
该公司生产的纳豆激酶主要成分为纳豆杆菌发酵液的浓缩制品，还含有谷氨酸、果糖朊和其他蛋白酶等。有液体、浓缩液和颗粒状粉末三种制剂。产品的质量标准为：纳豆激酶活性：18 000FU/g；细菌数量＜103 cfu/g；大肠杆菌数量阴性；重金属＜2 ppm；砷盐＜10 ppm；pH 6.0～8.0；水分＜5%。该品作为功能性食品的原料用于改善血液循环。用量：150～200mg（18FU/mg）/次，每天3次。
韩国维寿酶公司生产的以纳豆激酶为主要成分的维寿酶肠溶胶囊，每克干粉含20 000FU，服用量为2 000FU/日。纳豆中含有一定量的维生素K2，可有助于控制骨质疏松症。作为每日食品的营养补充剂，每日一粒胶囊。
朝鲜医学科学院推出的“血宫不老精”为纳豆激酶制品。在1996年5月的朝鲜国家技术创新博览会上曾获得国家最高荣誉奖，并得到外国专家的一致好评。它是从朝鲜食品埃里谢中提取、加工制成的纳豆激酶混合物。有效成分为纳豆激酶，含量为10 000FU（相当60mg纳豆激酶）/粒，玉米淀粉（140mg/粒）为辅料。其被吸收后2～3h内即能发挥作用，可用于治疗和预防血栓、瘫痪、四肢麻木、急性心肌梗死、半身不遂、言语紊乱、头痛、头晕、虚弱、高血压和低血压、脑血栓前后的综合症状、脂肪肝、心肌肥大、动脉硬化、高脂血症、心绞痛、冠心病等。可中和体内毒素，用于老年痴呆和老年综合征的预防与治疗，还可用于降低血液黏度，净化、更新血液。
“血宫不老精”在朝鲜平壤医科大学附属医院等12家中心医院的临床研究指出，其疗效为89.29%，在治疗过程中，病情未见好转的仅0.09%。这份近30万份病历的临床观察和总结为目前所见关于纳豆激酶临床研究的最为完整的报告。
随着人们生活水平的提高，大量摄取高脂、高蛋白等物质，导致心脑血管疾病呈高发态势，对人类生命安全构成威胁。而现有的治疗心血管疾病的药物均存在种种弊端。因此，寻求一种成本低、工艺简单并可大规模工业化生产纳豆激酶的方法是十分必要的。我们还可以利用食品生物技术如基因工程、酶工程、细胞工程等，对纳豆中的纳豆激酶进行研究，拓展我国传统的大豆制品，开发新产品，满足人们的需求。
参考文献