第二章　纳豆激酶的分子结构与生物合成

第一节　纳豆激酶基因与分子结构

一、纳豆激酶的基因

1992年，通过DNA测序，首次得到了纳豆激酶基因序列信息。其基因由1473个碱基对组成（图2-1），基因序列从第181个碱基开始，以GTG为起始密码子，随后是1143个碱基对组成的阅读框架。此阅读框架分为3个部分：信号序列、前序列和成熟序列，起始密码子上游的11～17 bp位点是SD序列（AAAGGAG），SD序列在核糖体同mRNA结合过程中起重要作用。SD序列的上游存在的是纳豆激酶基因的转录调控区，富含A/T碱基，含量高达72%。在结构基因的3′末端为连续的3个终止密码子TAA、TAG和TAA。终止密码子之后还存在一段序列，为ρ因子非依赖性终止序列，序列如下：TA—AAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCT-TCTmA。[1]

纳豆激酶基因序列的测定，使利用基因工程的方法提高纳豆激酶活性及产量成为可能。近年来通过对纳豆激酶分子生物学特性的研究，人们认识到纳豆激酶与大多数枯草菌素（是一类由各种芽孢杆菌分泌的碱性丝氨酸蛋白质）在核苷酸序列及氨基酸组成上具有高度同源性。因此，进一步推断纳豆芽孢杆菌为枯草杆菌属，纳豆激酶是纳豆杆菌的一种发酵产物。

自从Nakamura等首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列以来，利用基因工程技术提高纳豆激酶活性及产量成为可能。近年来，我国研究人员利用基因工程菌生产纳豆激酶，使纳豆激酶基因的克隆、表达、纯化及表达产物的产量和活性方面的研究取得了重大进展。从枯草杆菌、纳豆杆菌、淀粉芽孢杆菌中克隆了纳豆激酶成熟肽基因，包括前导肽和成熟肽的纳豆激酶原基因，以及包括启动子、前导肽、信号肽和成熟肽的纳豆激酶全基因，分别重组到温控型和诱导型质粒载体上，实现了在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌中的表达。通过柱层析还分离纯化出了高纯度的纳豆激酶蛋白。1999年复旦大学医学院分子遗传学研究室的刘北域等[2]采用PCR方法从纳豆芽孢杆菌基因组中扩增了纳豆激酶原基因，其核苷酸序列与文献报道完全一致，将该基因重组到温控型表达载体pLY-4上，构建成表达质粒pESX-1，转化到大肠杆菌JF1125受体菌中，实现了纳豆激酶在大肠杆菌中的表达。

2000年华南理工大学的黄志立等[3]从纳豆杆菌中克隆了纳豆激酶原基因，其基因序列与文献报道的核苷酸同源性达99.08%，重组到温控型表达载体pBV220上，转化大肠杆菌HB101中，实现了纳豆激酶在大肠杆菌中表达，表达产物的表达率达12%，用CLT法测定表明表达产物具有溶栓活性，1mL菌液的溶栓活性相当于120 U尿激酶。外源基因在大肠杆菌中的遗传稳定性实验表明，传代21代，外源基因的丢失率达52%。2001年黄志立等[3，4]克隆了纳豆激酶结构基因，其基因序列与文献报道的核苷酸序列完全吻合，并将该基因重组到pTCZaA表达载体上，转化到毕赤酵母GS115中，研究外源基因在真核表达系统酵母中的遗传稳定性，结果表明，传代120代，外源基因的丢失率为0。可见，外源基因在酵母中具有很好的遗传稳定性。

2002年刘北域等[5]从纳豆芽孢杆菌基因组中克隆了包括启动子、信号肽、成熟肽及3′非翻译区在内的纳豆激酶全长基因，构建到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达质粒pBL上，纳豆激酶转化到枯草杆菌中并成功表达。表达产物用超滤浓缩、分子筛、离子交换等技术多步纯化，每升发酵液可得纯度高达95%的重组纳豆激酶约100mg。与t-PA比较，比活性达12 000 U/mg，收率为60%。2002年暨南大学生物工程研究所的谢秋玲等[6]克隆了纳豆激酶原基因，重组到温控型表达载体pBV220上，转化到大肠杆菌DH5α受体菌中。温度诱导表达后，SDS-PAGE电泳测试，在38 000处有一条明显的表达带，表达蛋白占菌体蛋白的20%左右，表达蛋白以包涵体形式存在，包涵体经变性、复性后，用CLT法测定具有溶栓活性。2002年四川大学的彭勇等[7]从解淀粉芽孢杆菌DC-4基因组中克隆了豆豉溶栓酶成熟肽基因（DFE），序列分析表明DFE基因长825 bp，编码275个氨基酸，与文献报道的纳豆激酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.0%和86.5%，构建成融合表达载体pET-Nde，转化大肠杆菌BL21中，在IPTG诱导下，表达的融合蛋白以包涵体形式存在，占菌体可溶性蛋白的40%，表明豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶。2002年彭勇等[8]又从纳豆杆菌基因组DNA中克隆了纳豆激酶成熟肽基因，与文献报道的核苷酸序列和氨基酸序列分别有93.4%和94.5%的同源性。重组到融合型表达载体上，经IPTG诱导后，表达的融合蛋白占菌体可溶性蛋白的26%。

从不同菌株中克隆的纳豆激酶成熟肽基因在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌中表达（表2-1），其中有研究指出，在不含前导肽时表达的分泌型重组纳豆激酶和经过复性的包涵体型重组纳豆激酶均有溶栓活性。另有研究报道，分泌型和包涵体型不能获得活性。也有人将前导肽和成熟肽的纳豆激酶原基因克隆并在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌中实现可溶性、包涵体型和分泌型表达，表达产物均有活性（表2-2）。[9]

表2-1　纳豆激酶成熟肽基因的表达比较[9]

注：所有基因均为成熟肽。

表2-2　纳豆激酶原基因的表达比较[9]

注：所有基因均为原基因。

二、纳豆激酶分子结构

纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的枯草杆菌蛋白酶类。在酶学分类上称为枯草杆菌蛋白酶NAT（Subtilisin NAT），是一种碱性蛋白酶。根据纳豆激酶基因的DNA序列推导出其氨基酸序列的一级结构，可知纳豆激酶的前体为编码381个氨基酸的蛋白产物。此前体切除N端的106个氨基酸残基后成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶（酶学编号EC 3.4.21.62）（图2-2）。

N端106个氨基酸残基片段包括两部分：一部分是信号肽，另一部分为前导肽（propeptide）。信号肽是由N端29个氨基酸残基组成的，它是带3个正电荷的亲水氨基端和一段不带电荷的疏水残基序列，其切割位点在Ala-Glu-Ala保守序列之后。信号肽的作用是使纳豆激酶分泌到细胞外。

前导肽为信号肽与成熟肽之间的氨基酸序列，它具有帮助纳豆激酶正常折叠形成活性构象的功能。前导肽序列是纳豆激酶不同于多数原核基因所编码蛋白质的特点，而这种特征与真核细胞内蛋白酶分泌需要前导肽是一致的。在很多情况下，真核细胞在分泌蛋白酶之前，先在胞内合成无活性的酶原，分泌到胞外后，被酶水解，切断前肽部分成为有活性的蛋白酶，但这种分泌现象在原核生物中是比较罕见的。目前已发现一些与纳豆激酶基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。去除信号肽的纳豆激酶蛋白前体的产物（含前导肽和成熟肽）称为纳豆激酶原（pro-nattokinase）。

纯化的纳豆激酶在SDS-PAGE凝胶上只显示出一条带，说明纳豆激酶是一单链多肽酶，无二硫键。纳豆激酶的序列中含有8个赖氨酸残基，但没有半胱氨酸残基，且内肽酶可将其水解成9个小肽，成熟肽的单链氨基酸序列组成与氨基酸序列测定得到的结果也相符（图2-3）。[10]

三、纳豆激酶与其他枯草杆菌蛋白酶的同源性比较

纳豆激酶同其他枯草杆菌蛋白酶具有较高的同源性，其氨基酸序列同枯草杆菌蛋白酶E和枯草杆菌蛋白酶J比较，分别仅有2个和4个氨基酸不同。纳豆激酶成熟区域的一级结构同枯草杆菌蛋白酶E、枯草杆菌蛋白酶A分别具有99.5%和99.3%的同源性。同其他枯草杆菌蛋白酶比较，纳豆激酶表现出与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg有69%的同源性；与枯草杆菌蛋白酶BPNc有85%的同源性；与枯草杆菌蛋白酶DY有70%的同源性，其同源序列都在氨基酸活性中心周围。因此，普遍认为，枯草杆菌蛋白酶有启动并指导枯草杆菌孢子形成的功能，推测其可能在协助细胞裂解，释放孢子过程中发挥作用。尽管这些枯草杆菌蛋白酶一级结构非常一致，但它们却在一些酶动力学参数以及底物特异性上不同，估计与空间构象不同有关。[11，12]

根据纳豆激酶的氨基酸序列，可预测出它的二级及三级结构，并可利用同源模建技术构建出纳豆激酶分子的三维空间结构模型（图2-4）。纳豆激酶的成熟肽主要是由12个β折叠和6个α螺旋构成，6个β折叠片组成的折叠桶和2个α螺旋主要构成其内部结构。活性中心位于α螺旋和β片层构成的疏水袋状结构中，包括一个催化三联体（由天冬氨酸Asp-32、组氨酸His-64和丝氨酸Ser-221组成）、负氧离子洞（oxyanionhole，由Asn-155侧链和丝氨酸Ser-221主链的氨基共同形成）和底物结合位点（在丝氨酸Ser-125，亮氨酸Leu-126，甘氨酸Gly-127处，位于底物结合口袋的底部）。[13]

（a）纳豆激酶的空间结构图；（b）含活性中心的纳豆激酶与H-D-VLK-pNA结合的三维模式图