5.3 食物中毒性细菌

常见食源性病原菌、主要特性及其污染食品等相关信息见表5-3-1。

5.3.1 沙门氏菌属（Salmonella） 

5.3.1.1 食品卫生学意义

沙门氏菌属是肠杆菌科中的一个大属，至今已发现近2463个血清型。它们是在形态结构、培养特性、生化特性和抗原构造等方面极相似的一群革兰氏阴性杆菌。主要由动物和胃肠道携带而污染环境及食品。

沙门氏菌与食品卫生和人类健康息息相关，知道该菌可以引起人类疾病已经有100多年的历史了，沙门氏菌最早是由一名叫Salmon的美国人发现，并从此而命名。它是引起食物感染与食物中毒的重要致病菌，是最常见的食源性疾病的病原微生物。据我国和世界各国的统计资料证明，沙门氏菌引发的食物中毒在细菌性食物中毒占据首位，现已成为食品公共卫生方面的重要问题。在2004年FoodNet监控的感染性疾病实验室诊断15806例病例中沙门氏菌占6464例，空肠弯曲菌占5665例，志贺氏菌占2231例，隐孢子虫占613例，出血性大肠杆菌O157∶H7占401例，耶尔森氏菌占173例，弧菌属占124例，李氏杆菌占120例，环孢子菌（cyclospora）占15例。我国的情况也是如此，为此，在食品卫生检验、特别是动物源性食品的检验或致病菌检验中，将沙门氏菌的检验列为重要的检验项目之一。

沙门氏菌广泛地存在于自然界，包括各种家畜、家禽、野生动物、鼠类等体表、肠道和内脏以及被动物粪便污染的水和土壤中。有的畜禽生前患有沙门氏菌病、外伤、疲劳、消瘦以致抵抗力下降时，这些细菌就进入动物血液和肌肉内呈全身感染。在其肉及内脏中则会带有更大量的沙门氏菌，通过畜禽屠宰、加工、运输、贮存、销售、烹调等各个环节污染食品。另外，饮食行业从业人员是沙门氏菌病患者或带菌者等情况也是一个重要的污染源。饲料被污染，导致动物带菌或感染；水产品受到水源污染。食品被沙门氏菌污染后，在适宜的环境条件下增殖，当人们食入含有一定数量沙门氏菌的食品后，即可发生感染和中毒。一般认为中毒菌量为10⁵以上。沙门氏菌虽然型别较多，但能够引起人类疾病的也就100多种血清型，因此，鉴定沙门氏菌致病与否也是一项很困难的工作。

沙门氏菌属可分为肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌两个种，肠道沙门氏菌几乎包括了所有对人和温血动物致病的各种血清型菌种。但通常沙门氏菌的命名仍用通用命名法，即以该菌所致疾病或最初分离地名或抗原三种方式命名。据调查统计，引起人类食物感染与中毒的沙门氏菌常见有28个血清型，其中主要的是鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、肠炎沙门氏菌（S.enteritidis）、都柏林沙门氏菌（S.dublin）、汤卜逊沙门氏菌（S.thompson）、纽波特沙门氏菌（S.newport）、爪哇沙门氏菌（S.javiana）、海德堡沙门氏菌（S.heidelberg）等，它们占沙门氏菌食物中毒的60%～70%。在2004年美国CDC调查的5942例沙门氏菌分离株中（占总沙门氏菌实验室鉴定菌株的92%），有5个血清型占到56%，其中鼠伤寒沙门氏菌1170例（20%），肠炎沙门氏菌865例（15%），纽波特沙门氏菌585例（10%），爪哇沙门氏菌406例（7%），海德堡沙门氏菌304例（5%）。2009年中国CDC报告对2004～2007年全国652起微生物性食物中毒事件中，中毒28638人，死亡47人，由沙门氏菌引起的起数占18.71%，中毒人数占24.27%，为中毒起数第二位，中毒人数第一位；以B群和D群血清群出现频率最高。

根据沙门氏菌对宿主的适应性，可分为三类：①对人适应：一些血清型如伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌对人类高度适应，没有其他自然宿主。②对人和动物均适应：该类菌具有广泛的宿主范围，具有重要的食品卫生学意义，占据本菌属大多数，如鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌属于该类，它们宿主范围宽，可感染大多数动物宿主。③对某些动物适应：如猪霍乱沙门氏菌只有很窄的宿主范围，偶尔可感染人类，不过这类细菌不能忽视。当猪霍乱沙门氏菌感染人类时，通常表现为侵袭性感染，最常见的临床症状是组织动脉瘤，感染猪则引起猪副伤寒，表现为肠炎和败血病症状，对畜牧业造成严重的经济损失。猪霍乱沙门氏菌感染人类后抗生素治疗是非常重要的治疗方法，但该菌株对氨苄青霉素和氯霉素及甲氧氨苄嘧啶已经出现了明显的抗性，抗生素治疗猪霍乱沙门氏菌感染成为临床治疗和预防密切关注的问题。

引起沙门氏菌感染和中毒的食品因地区而有不同，主要是动物源性食品，包括各种肉类、蛋类、乳类、水产品等，我国以肉类为主，日本则以鱼类为多。健康家畜沙门氏菌带菌率为2%～15%，鸡、鸭、鹅带菌率也较高，鸡带菌率为12%～14%，鼠带菌率为2%～4%，大型肉类加工厂，牛肉6.2%，猪肉为9%，鸡肉为19.5%；分散屠宰带菌率高，牛肉为42.1%，猪肉为33.6%，羊肉为14.3%，鸡蛋为2.6%～7%。因地区和环境不同，流行的菌株也有所不同。

5.3.1.2 主要特征

（1）形态及染色特征

该菌的形态与肠杆菌中其他菌属细菌相似，为两端钝圆的短杆菌，长1～3μm，宽0.4～0.9μm，无芽胞，一般无荚膜，具有周身鞭毛，能运动（鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌除外，无菌毛，不能运动），多数细菌具有纤毛（鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、仙台沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌除外），能吸附于细胞表面和凝集豚鼠的红细胞。普通苯胺染料容易着染，革兰氏染色阴性（图5-3-1、图5-3-2）。

（2）生长要求及培养特性

本菌属为需氧或兼性厌氧菌，生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃。最适宜pH为6.8～7.8。对营养要求不高，在普通培养基上均能良好生长。

① 普通琼脂 在37℃培养24h，形成中等大小、圆形或近似圆形、表面光滑、无色、半透明、边缘整齐的菌落。菌落大小为2～3mm，继续培养猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌，有时出现黏液体。其中鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、羊流产沙门氏菌等生长的菌落较小。

② S.S琼脂 由于S.S琼脂中含有胆盐及煌绿，可抑制大多数大肠杆菌的生长，而沙门氏菌则能生长，因沙门氏菌不分解乳糖，而形成无色或浅粉红色、半透明的圆形菌落。产生硫化氢的菌株，菌落中心呈黑色（图5-3-3）。

③ 亚硫酸铋琼脂（BS）产硫化氢菌株的菌落为黑色有金属光泽或棕褐色，或灰色，菌落周围的培养基亦呈黑色或棕色；不产生硫化氢的菌株，菌落呈灰绿色，培养基的周围无变化。

④ DHL琼脂（Deoxycholate Hydrogen Sulfide lactose Agar）菌落呈无色半透明。产硫化氢的菌株，菌落中心或几乎整个菌落呈黑色。

⑤ HE琼脂（Hektoen Enteric Agar）菌落呈蓝绿色或蓝色，产硫化氢的菌株，菌落中心或整个菌落呈黑色（图5-3-4）。

⑥ 普通肉汤 生长良好，均等混浊，无菌膜，有时有少量沉淀物。

⑦ 血液琼脂 菌落形态与普通琼脂上的菌落相似，稍大，部分菌株在菌落周围产生β型溶血环，如图5-3-3，图5-3-4。

⑧ 沙门氏菌显色培养基 多年以来国内外还发展了许多沙门氏菌显色培养基，这些培养基是经过改良的选择性培养基，使目标菌在改良培养基上的菌落显示出一定的颜色，便于识别。这类培养基的主要代表有法国生物梅里埃公司的SMID和法国科玛嘉的沙门氏菌显色培养基。生物梅里埃公司的SMID上生长的沙门氏菌为粉红色，法国科玛嘉的沙门氏菌显色培养基上的沙门氏菌典型菌落为紫色。

（3）生化特性

沙门氏菌虽有2463以上血清型，但绝大多数血清型的细菌生化特性非常一致。因此，生化特性对沙门氏菌的鉴定具有重要的意义。其基本生化特性如表5-3-2。

绝大多数沙门氏菌发酵糖类时均有产气现象，但伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及部分鸡白痢沙门氏菌不产气。

根据生化特性，沙门氏菌属分为5个亚属，其中亚属Ⅰ是生化特性典型的沙门氏菌，是最常见的沙门氏菌，亚属Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均为不典型生化特性沙门氏菌，亚属Ⅲ是亚利桑那菌，这5个亚属的生化特性见表5-3-3。亚利桑那菌分解乳糖，SS和DHL上菌落为红色，与其他沙门氏菌的无色透明及生化反应结果相差较大。亚利桑那菌最早是Caldwell和Reyerson于1939年在冷血动物中发现的，与沙门氏菌在生化和抗原上有一定相似性，但又有较大差异，在检验时往往因与其他沙门氏菌差别较大而漏检。其抵抗力特征与沙门氏菌差不多。广泛存在于禽类、哺乳类动物、爬虫类和环境中，并且可感染人类，引起人的胃肠炎。

5.3.1.3 抵抗力

沙门氏菌对热、消毒药及外界环境抵抗力不强，加热60℃15～20min即可被杀死，100℃立即死亡。在禽舍中，37℃可存活2周，23℃时存活18～19个月，7℃以下生存20个月。在-25℃低温冷冻，可存活10个月以上，因此冷冻保存食品对本菌无杀灭作用。在水中能存活2～3周，在冰或人的粪便中可存活1～2个月，在牛乳及肉类中能存活数月，在含10%～15%食盐的腌肉中能存活2～3个月，当水煮或油炸大块鱼、肉、香肠时，食品内的沙门氏菌达不到足以杀灭温度的情况下，细菌仍能存活，肉表面的沙门氏菌在温度适当时一昼夜可向肉的深部侵入1～2cm，往往成为食物中毒的原因。在5%石炭酸、0.2%氯化汞（俗称升汞）液、2%烧碱水等消毒液中5min即能致死。对胆盐、亚硫酸钠等化学药品以及煌绿、孔雀绿等染料的抵抗力强于其他肠道杆菌，故在沙门氏菌增菌和分离的培养基中，加上这类化学物质，可抑制其他的肠道杆菌，沙门氏菌仍能生长。

沙门氏菌与大肠杆菌一样，对抗菌药物耐药菌株日益增多，对药物的敏感性越来越低。许多耐药菌株具有耐药质粒，不仅抵抗一种抗菌药物，甚至抵抗多种抗菌药物。目前，大多数菌株能抵抗青霉素、链霉素、土霉素、磺胺类药等，对庆大霉素、氯霉素、呋喃唑酮等有较高的敏感性。

5.3.1.4 致病性

（1）基因组

目前，伤寒沙门氏菌Ty 2、CT 18和鼠伤寒沙门氏菌LT 2的全基因组测序工作已经完成，还有一些血清型沙门氏菌完成了部分基因组测序工作。

伤寒沙门氏菌CT 18的基因组大小为4809037bp，与大肠杆菌K 12基因组比较有几百个大小不同的基因插入与缺失，而且有200多个伪基因，基因组中多处发生突变可能与毒力或宿主范围有关。有几个明显的插入基因，一些插入基因如致病岛、噬菌体对细菌在宿主中生存及其致病性有很大关系。这些插入基因包括编码Ⅲ型分泌系统的蛋白、效应蛋白和金属离子转运的基因。沙门氏菌CT18携带两种隐含性质粒，质粒pHCM1（218150bp）和pHCM2（106516bp），质粒pHCM1编码抗药基因，质粒pHCM2与鼠疫耶尔森氏菌始祖相类似。

伤寒沙门氏菌Ty 2基因组由4791961bp组成，G+C平均值为52.05%。与伤寒沙门氏菌CT 18基因组进行比较，4646基因中的29个是Ty 2特有的，而84个基因是CT 18特有的，这两个基因组都包含200多个伪基因，这两个菌株在前噬菌体、插入序列和致病岛结构方面显示出不同。CT 18菌株携带两个质粒，一个具有多种药物抗性，Ty 2菌株没有质粒，对抗生素敏感。复制起始子和终止子约3750kb和1544kb，Ty 2有7个rRNA操纵子，Ty 2操纵子是rrnG-rrnH杂交物，有可能通过同源重组介导易位。虽然同源重组并不能改变rRNA组织结构，但这样的重排常常导致核糖体表型差异，核糖体表型变化与宿主适应性有一定关系。

鼠伤寒沙门氏菌LT 2的染色体基因大小为4857432bp，而其毒力质粒pSLT基因大小为93939bp，该菌LT 2基因与8种肠道细菌有密切相关的同源基因序列。鼠伤寒沙门氏菌LT 2基因和质粒的特性详细资料可登录http://genome.wustl.edu/gsc/Projects/S.typhimurium查询。鼠伤寒沙门氏菌LT 2和伤寒沙门氏菌CT 18的伪基因数不同，研究人员认为鼠伤寒沙门氏菌LT 2的宿主范围较广，是伪基因数较少的缘故，伤寒沙门氏菌只感染人类，与其伪基因数较多有关。

此外，一株多种抗生素抗性菌株猪霍乱沙门氏菌SC-B 67从一个脓毒血症的病人中分离出来，分离株猪霍乱沙门氏菌SC-B 67的全基因序列测序工作已经完成，其基因组序列于2004年发表，染色体基因组由4755700bp组成，携带一个138742bp大质粒，命名为pSC 138；一个49558bp毒性质粒，命名为pSCV 50。复制起始子和终止子接近1647Mb和4010Mb。猪霍乱沙门氏菌是高侵袭性非伤寒沙门氏菌，通常可引起脓血症，由于多种抗菌成分的存在，感染后治疗尤其困难，多种药物抗性的菌株基因组序列完成，经与伤寒沙门氏菌CT 18和鼠伤寒沙门氏菌LT 2比较，猪霍乱沙门氏菌SC-B 67缺失发生较多，有151个伪基因，与沙门氏菌其他基因组比较，其中包含了高频率的参与细菌抗药信号转导基因转化而来的伪基因。为此有人提出伪基因的形成可能提供一种简单的进化路径来完成毒力基因和抗菌素基因的获得。

对沙门氏菌基因组的研究使其致病机制和毒性因子的研究更为深入，也为其疫苗发展奠定了基础。

（2）致病岛

沙门氏菌致病岛是指沙门氏菌在进化过程中形成的、主要决定其致病作用的基因组区域，它位于细菌的染色体上，至少由60个基因组成的长基因序列，包括SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5，决定沙门氏菌全部毒力的基因一部分位于质粒上，大多数由染色体上的致病岛编码。

① SPI-1 位于染色体上63nt处的SPI-1介导其对肠道上皮细胞的侵袭，它在沙门氏菌进化过程中起非常重要的作用。SPI-1大约40kb长，编码28个基因，其中至少有17个基因编码Ⅲ型分泌系统，与其他肠道病原菌的Ⅲ型分泌系统具有同源性。与沙门氏菌对肠道上皮细胞侵袭力有关。SPI-1不与tRNA相连，G+C碱基组成含量为47%，低于整个基因组G+C平均含量52%。DNA遗传的流动性在SPI-1表现不明显，临床分离株的致病岛比较稳定，但也有报告在环境中分离到肠炎沙门氏菌Senftenberg和Litchfield缺失了SPI-1的主要部分。沙门氏菌的侵袭受多种调控因子的调节，SPI-1上至少有invF、inv、iagA三个调控基因参与侵袭过程。SPI-1调节表达是一个复杂的过程，具体机制目前还不完全清楚，有资料证明SPI-1表达受环境和SPI-1编码的调解子HilC、HilD、HilA和InvF影响。

② SPI-2 SPI-2的功能是沙门氏菌致病的第二个重要特点，SPI-2编码Ⅲ型分泌系统的蛋白，能引起系统感染并在宿主组织中增殖，这一毒性特征与肠炎沙门氏菌在宿主巨噬细胞中存活复制有关，SPI-2编码的T 3SS缺失突变株毒性大大降低，此菌株可以作为抗伤寒疫苗或重组疫苗载体。SPI-2具有240kb长，与valVtRNA相连，在此有一个9kb没有毒性功能的插入序列。SPI-2很稳定，比较各种各样血清型肠炎沙门氏菌，SPI-2明显是保守的。SPI-2有至少两个遗传单位的镶嵌结构，其中25kb编码T3SS，G+C含量较低（43%）；15kb的部分类似基因组，含有编码新陈代谢作用的基因，如连四硫酸盐还原酶。SPI-2编码一个双组分调节系统，该系统由包括传感蛋白SpiR-SsA和应答调控蛋白SsrB，920个氨基酸序列的SpiR-SsaA蛋白具有两个跨膜区。

③ SPI-3 SPI-3的基因结构和功能不同于SPI-1和SPI-2，SPI-3与沙门氏菌在巨噬细胞内及在镁离子不足条件下存活有关。这个致病岛约17kb，插入在selCtRNA下游，碱基组成类似核心基因组。SPI-3两个IS插入元件位于SPI-3的中心区，此外，不同亚类的沙门氏菌SPI-3结构不同，SPI-3编码的主要毒性因子是高亲和力镁传输系统MgtCB，对沙门氏菌细胞内作用非常重要，MgtB和MgtC定位于内膜，MgtB介导镁转运，MgtC的功能还不清楚。

④ SPI-4 是位于鼠伤寒沙门氏菌染色体下游92nt处，长25kb，SPI-4编码Ⅰ型分泌系统，含有编码T1SS毒素的基因，还包括巨噬细胞存活必须的基因，为此与沙门氏菌在巨噬细胞中存活有关。SPI-4在沙门氏菌中的毒性作用还没有详尽的研究。

⑤ SPI-5 SPI-5大小为7kb，G+C含量43.6%，位于serTtRNA下游SPI-5含有编码SopD的基因，pipA、pipB、pipC、pipD基因。具有致肠道液体分泌和炎性反应作用，不具有与全身感染有关的基因。

⑥ 主要致病岛PAI有一个致病岛是伤寒沙门氏菌特有的，在其他肠炎沙门氏菌亚类中没有，命名为主要致病岛。大小为146.9kb，与pheUtRNA基因相连，主要致病岛包含几个毒性因子：a. viaB基因合成伤寒沙门氏菌的Vi荚膜多糖；b. sopE前噬菌体含有的sopE基因，编码SPI-1系统的一种效应蛋白；c.一个基因簇编码伤寒沙门氏菌具有侵袭上皮细胞功能的4种菌毛蛋白；d.主要致病岛含有与DNA迁移有关的几个基因，形成多种水平传播获得的镶嵌结构。

⑦ SGI-1 多种抗性菌株如DT104的出现是沙门氏菌感染治疗的一大难题，对这些分离株抗性因子的特性进行研究，鉴定了多种抗性菌株沙门氏菌Typhimurium和Agona的基因岛（即沙门氏菌基因岛SGI-1），SGI-1大小是43kb，在DR侧面。多种与DNA迁移率有关的因素如转座酶、整合酶和切除酶基因均在SGI-1内发现，有5种抗性表型的基因聚集在多种药物抗性区，与质粒编码的抗生素抗性因子比较，在缺乏抗生素抗性的情况下位于染色体的SGI-1明显稳定，在肠道沙门氏菌Agona中也检测到基因岛SGI-1，这表明SGI-1在其他血清型之间也可能发生传播。

（3）中毒表现

潜伏期一般为12～36h，短者6h，长者48～72h，大多集中在48h内，超过72h者不多。潜伏期短者，病情较重。中毒初期表现为头痛、恶心、食欲不振，以后出现呕吐、腹泻、腹痛。腹泻一日数次至十余次，或数十次不等，主要为水样便，少数带有黏液或血。体温升高，为38～40℃，或更高，一般在发病2～4d体温下降。多数病人在2～3d后胃肠炎症状消失。较重者可出现烦躁不安、昏迷、抽搐等中枢神经系统症状，也可能出现尿少、呼吸困难等症状。同时还可能出现面色苍白、口唇青紫、四肢发凉、血压下降等衰竭症状，甚至休克，如不及时救治，最后可因衰竭而死亡。沙门氏菌食物中毒有多种表现，一般可分为五种类型：

① 胃肠炎型 突然发病，发烧，体温可达38～40℃以上，伴有恶寒、恶心、呕吐、腹泻、腹痛。主要是由鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等引起。

② 类伤寒型 病情缓和，突出有高烧，体温可达40℃以上，头痛、全身无力、四肢痛、腓肠肌痛或痉挛、腰痛及神经系统功能紊乱。多数由甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌所引起。

③ 类霍乱型 有剧烈的腹泻、呕吐、体温升高、恶寒、全身无力、腹痛，还可出现严重脱水以至循环衰竭。

④ 类感冒型 体温升高、恶寒、全身不适、四肢及腰部疼痛、鼻塞、咽喉炎等上呼吸道症状。

⑤ 败血症型 起病突然，有高烧、恶寒、出冷汗和轻重不一的胃肠炎症状。主要由猪霍乱沙门氏菌引起。

沙门氏菌食物中毒发病率较高，高者可达80%～90%，一般为40%～60%。一般病程为3～7d，病死率通常为0.3%～0.5%。

5.3.1.5 抗原构造

沙门氏菌具有复杂的抗原构造，一般可分为菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原、表面包膜（K）抗原和菌毛抗原。O抗原和H抗原是沙门氏菌的主要抗原，是构成沙门氏菌血清型鉴定的基础，其中O抗原是每个菌株的必有成分。

① O抗原 存在沙门氏菌细胞壁表面的一种抗原，多数菌株具有一个以上的O抗原。其化学组成为类脂-多糖-多肽复合物，O抗原决定簇由该侧链上末端单糖及多糖链上的单糖的排列顺序所决定，O抗原的性质较稳定，耐热性强，100℃煮沸2～3h不被破坏，能抵抗酒精或0.1%石炭酸。

O抗原由许多成分组成，共有60余种，以阿拉伯数字1、2、3、4…代表，每种细菌常常含有数种菌体抗原，其中一群细菌独有的，其他菌群则没有的，对这部分抗原称为主要抗原，如2、4、7、8、9、3、10、11等，我们以这些主要抗原为基础，将整个沙门氏菌属分为42个群，即OA～OZ和O51～O67。详见表5-3-4。还有一些抗原是在两群或几群细菌所共有的，这些抗原则称为次要抗原，如1、5、12……。由人及哺乳动物分离的沙门氏菌，98% 以上均属于A～E群。沙门氏菌已有2463个血清型被发现，我国已发现26个菌群、161个血清型。O抗原见表5-3-4。

在这些菌群中，对人致病的沙门氏菌通常为属于A～F各O群的常见菌型，占90%～95%。

虽然沙门氏菌的血清型很多，但是多数国家从人体、动物和食品中分离出的沙门氏菌仅40～50个血清型，而在一个国家中的一定时期内只约有10个血清型是比较常见的。在很多国家沙门氏菌食物中毒多由鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌所引起，我国也是如此。

O抗原有时会发生变异，一是S-R或S-T-R变异，即光滑型（S）-粗糙型（R）变异，S型菌含有典型O抗原，R型菌则不含正常O抗原。有时S型菌O抗原也不一定是完整的，这是因为沙门氏菌在发生S-T-R变异，T型菌也不含正常的O抗原，而其菌落是S型的；二是O抗原量的改变，即有些菌落的细菌含有多量抗原，与O血清作用时，凝集明显，而有些菌落的细菌O抗原量少，与O血清作用时，呈弱凝集或不凝集，还有就是沙门氏菌被某些温和性噬菌体感染而溶源化，结果导致其O抗原因子也发生相应的改变。能使本属菌O抗原发生溶源性变异的噬菌体已有10余种。

② H抗原 存在于鞭毛之中，称为鞭毛抗原，其化学成分为蛋白质，其特异性由多肽链的氨基酸排列顺序及空间构型所决定，不耐热，加热60℃经30～60min即可被破坏。酒精也能破坏其抗原性。具有鞭毛的细菌经甲醛固定后，其菌体抗原即全部被遮盖，不能与菌体抗体发生凝集反应。

沙门氏菌鞭毛抗原有两种，称为第一相和第二相。第一相具有较高的特异性，仅为少数沙门氏菌所独有，称为特异相。用小写英文字母a、b、c、d…z表示。第二相鞭毛抗原特异性较低，为多种沙门氏菌所共有，称为非特异相，用阿拉伯数字1、2、3、4…表示。但也有少数细菌例外，含有第一相鞭毛抗原中的e、n、x、z等抗原成分。

凡具有两相抗原的细菌，既具有第一相鞭毛抗原，又具有第二相鞭毛抗原，称为双相菌，大多数沙门氏菌均属此类。如鼠伤寒沙门氏菌（1、4、5、12∶i∶1.2）；有的只含一相鞭毛抗原，称为单相菌，如肠炎沙门氏菌（1.9、12g.m∶—）、马流产沙门氏菌（4、12∶—∶enx）。沙门氏菌中有极少数无鞭毛细菌，两相鞭毛抗原都没有，称为无相菌，如鸡白痢沙门氏菌（9、12∶—∶）。H抗原分类及命名详见表5-3-5。

③ Vi抗原 Vi抗原位于菌体最表面，是一种N-乙酰-半乳糖醛酸聚合物，属于K抗原范畴。不耐热，经60℃加热1h，1mol/L HCl 37℃处理30min，0.05mol/L NaOH室温处理4h，以及50%乙醇作用均可破坏其凝集性，或经多次传代培养后，Vi抗原容易消失。Vi抗原可阻止O抗原与相应抗体结合，只有当Vi抗原消失后，方能出现O凝集反应。本属细菌中只有少数菌具有Vi抗原，如伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌。

根据Kauffmann与White的抗原分类表，先根据O抗原的种类分为若干群，用A、B、C、D、E、F……再根据H抗原的组成，将每群菌分为若干个血清型或变种。常见的沙门氏菌的抗原构造见表5-3-6。

5.3.1.6 毒素

本属细菌均不产生外毒素，但有许多细菌能产生毒力较强的内毒素和肠毒素。

① 肠毒素 已知有些沙门氏菌血清型可以产生肠毒素。在鼠伤寒沙门氏菌中发现一种热敏的、细胞结合型的霍乱毒素样肠毒素，它在结构、功能和抗原性上与霍乱弧菌和肠产毒性大肠杆菌的LT1相似，可引起CHO细胞伸长，在兔结扎肠中诱导液体分泌，与GM1神经结苷脂结合，可提高兔肠细胞内cAMP和前列腺素E2水平，其生物学活性可被抗CT抗体所中和，有A和B两种亚单位，分子量可能分别为25000u和12000u。在本菌还发现另一种肠毒素，引起CHO细胞伸长，并致兔肠积液，但其活性不被CT抗血清中和。Kuhn等报告几个沙门氏菌的培养滤液在幼鼠试验和兔肠袢试验中都诱发了液体积累反应，这种肠毒素不耐热，在100℃，10min即被破坏。

② 细胞毒素 因为沙门氏菌感染可引起肠黏膜损伤，有几个血清型沙门氏菌全细胞超生裂解液含有一种不耐热的细胞毒素，是一种与志贺毒素类似的细胞毒素，可引起广泛的Vero细胞脱落，它可以抑制Vero细胞蛋白质合成。

5.3.1.7 细菌学检测

沙门氏菌检验方法很多，根据不同的检测对象，采用不同的检测程序和方法。对未污染的被检组织可直接在普通琼脂、血琼脂或鉴别培养基平板上画线分离，但已污染的被检材料如饮水、粪便、饲料、肠内容物和已败坏组织等，因含杂菌数量远超过沙门氏菌，故常需要选择性增菌培养基增菌后再行分离。增菌培养基最常用的用亮绿-胆盐-四硫磺酸钠肉汤、四硫磺酸盐增菌液、亚硒酸盐增菌液以及亮绿-胱氨酸-亚硒酸氢钠增菌液等。鉴别培养基常用麦康凯、伊红美蓝、SS、去氧胆盐钠-枸橼酸盐和HE等琼脂，必要时还可用亚硫酸铋和亮绿中性红等琼脂。

① 食品的沙门氏菌检验 由我国卫计委统一颁布的标准检验方法《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB/T 4789·31—2013），适用于食品和中毒样品中沙门氏菌的检验（图5-3-5）。

② 《GB 4789·31—2013食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》 对冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应用缓冲蛋白胨水进行前增菌，然后移种于四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）和亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）内进行增菌。而对鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未加工的食品不比经过前增菌。因为加工过的食品对其中的沙门氏菌具有一定损伤，这些受伤的沙门氏菌在一定条件下又可恢复其致病力，因此，要把这部分菌鉴定出来。

该标准还明确了噬菌体检验标准。

③ 其他检测及分型技术 由于沙门氏菌常规检验程序繁杂，给加工生产及销售、食用带来不便。为此，国内外对沙门氏菌的快速检验进行了大量的研究工作，许多方法正在逐步推广应用。

a.荧光抗体技术：国内曾使用A-F群或A-61群多价诊断血清制备的荧光抗体检测样品中沙门氏菌，与常规法相比阳性符合率约为90%，有快速、敏感的优点。

b.ELISA：用沙门氏菌的单抗-夹心ELISA法对人工污染A-F群的沙门氏菌的样品只需增菌18h即可检出，对现场肉样能在48h内准确报告结果。

c.单克隆抗体技术：用A-F群沙门氏菌主要O抗原的单克隆抗体，以及抗沙门氏菌共同鞭毛蛋白的属特异性单克隆抗体，用直接凝集、免疫荧光和ELISA等方法检测A-F群沙门氏菌。近来又用酶标记的属特异性单抗和O9单抗建立了单抗竞争ELISA，几乎能鉴别出现有已知的各种血清型的沙门氏菌，这为沙门氏菌的检验提供了一种简单、快速的血清学诊断方法。

国内外也有使用多种商品化的生化快速检定系统，如API系统、R/B系统、肠管（Enterotube）系统等，其中以API系统应用较为广泛。近年来BAX系统在许多国家用于沙门氏菌的快速检测，对生产过程和流通环节的食品进行检测，使食品生产过程中的污染发生率尽量减小。

沙门氏菌分子生物学分型方法主要有：脉冲场电泳（PEGE）分子分型，扩增片段长度多态性（AFLP）分型，限制片段长度多态性（RFLP）分型、随机扩增多态DNA（RAPD）分型和核糖体分型技术等。PEGE方法在流行病学调查中较常用，例如调查1997～1998年Finland地区纽波特沙门氏菌暴发情况就使用PEGE方法（XbaⅠ酶切）。

探针检测目前已经有商品化的基因探针试剂盒，如GENE-TRAK DNA杂交筛选法（AOAC方法：1987，1990），免疫磁珠分离法以及核酸探针和PCR等方法用于沙门氏菌检测的研究也较多。

此外，近十多年来，国外不少学者还研究了多种快速鉴定本属菌的方法，如抗体包被的有色乳胶颗粒凝集试验、C8脂酶快速法、PG琼脂推断性鉴定法等。

5.3.1.8 食品生产的综合控制

由于沙门氏菌传播的广泛性，血清型多样性以及大量耐药菌株的存在与流行，使得沙门氏菌感染的防治成为食品行业的一大难题。没有疫苗能够完全防止沙门氏菌感染，动物性食品都可能被沙门氏菌污染。为此人们在日常生活中不要吃生肉或没有烹饪的鸡蛋及没有杀菌的牛奶，这样可以减少沙门氏菌感染的机会，此外防止交叉污染也是控制沙门氏菌污染的重要措施。

食品加工厂引入HACCP管理模式，在减少成品中食物源性病原体方面已经取得了显著成效，在美国对所有食品厂的要求是：如果适合都应当建立HACCP管理体系，生产单位须具有追踪食源性病原体的能力，在我国一些食品企业，HACCP管理体系也在大力推行，对于关键控制点、关键界限或评价关键界限的监控步骤的建立，应根据各企业实际情况自行确定。

改善动物性食品的卫生安全，首先通过对养鸡场和养猪场进行管理，有一些公司根据本公司情况确定了一些关键控制点，总的来讲可能出现问题的环节包括：带菌动物的存在，健康动物与粪便的接触，环境卫生管理，使用循环水的卫生，饲用污染的饲料，用污染的水浇灌牧草，未处理粪肥的传播，感染的鸟类和啮齿类动物，选择确定关键控制点可以从这些环节入手。其次，在畜禽屠宰过程、包装及运输过程中良好的管理都有助于控制食品污染，此外还需要对食品工业工人进行基本的食品安全教育，防止食品交叉污染和其他导致食物中毒暴发的错误发生，未来可以使用辐射灭菌或其他处理方法减少生肉的污染，熟肉制品要注意保存条件，食用前充分加热。

① 沙门氏菌疫苗的研制开发 目前应用和正在研制的沙门氏菌疫苗多限于预防各种家畜特有的沙门氏菌病，例如猪副伤寒、马流产及牛、羊的都柏林沙门氏菌的灭活菌苗，在国内外均已应用。兽用沙门氏菌疫苗一方面可以减少畜禽产品中沙门氏菌的带菌率，减少人类感染沙门氏菌的机会，其次，可以减少动物疾病发病率，提高由于沙门氏菌感染给畜牧业造成的经济损失。

随着人们对沙门氏菌致病因子以及功能基因进一步了解，通过多种方法对沙门氏菌进行减毒已成为可能。减毒菌株感染宿主后，可在体内长期存活并诱导机体产生保护性免疫反应，同时，沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，减毒沙门氏菌运载外源基因的真核表达质粒可在体细胞内进行持续表达，诱导产生特异性的体液和细胞免疫应答。因此，减毒沙门氏菌既可作为针对同源抗原的活菌苗，也可作为疫苗的载体，诱导针对其他病原微生物的免疫保护性反应。

近十多年来，临床实验证实Ty-21a株减毒口服活菌苗的副反应较小，免疫效果且较持久。Ty-21a活菌苗是筛选得到缺少尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶的伤寒杆菌突变株，该菌株失去合成脂多糖的能力，故无发热反应，无返祖现象，服用安全，以产生细胞免疫为主，美国志愿者实验证明可提供87%的保护效果，1989年获FDA批准生产，此菌株安全、稳定、有效免疫期至少为三年。目前进行研究的疫苗还有沙门氏菌营养缺陷缺失突变株的构建与鉴定，如CVD908-htrA，该菌株研究的目的是减少免疫次数而保持同样的免疫效果。提取Vi抗原制备的Vi伤寒多糖苗在瑞士、我国等几个国家均已批准生产，Vi是位于菌膜外的荚膜多糖抗原，由乙酰-氨基糖醛酸高度聚合而成，可阻止外膜与补体结合，对细菌的入侵有一定预防作用。在此基础上有人正在进行Vi多糖与蛋白交联结合苗的研制。

② 国外在沙门氏菌防治方面做的工作 在美国沙门氏菌感染的发病率是由疾病预防控制中心（CDC）负责监测，CDC协助调查各地区沙门氏菌爆发事件，制定控制该菌污染的方法，指导相关部门对沙门氏菌进行检测鉴定，食品和药品监督管理局FDA负责检测进口食品及牛奶，改善食品在餐厅和生产加工过程中的制备技术，FDA还控制调整动物性食品中抗生素的使用，美国农业部检查食用动物的健康，控制屠宰厂和肉制品加工生产过程的质量，美国环境保护机构负责控制和监控饮用水的安全。

5.3.2 变形杆菌属（Proteus） 

5.3.2.1 食品卫生学意义

本菌属曾包括普通变形杆菌（P.vulgaris）、奇异变形杆菌（P.mirabilis）、摩根变形杆菌（P.morganii）、雷极氏变形杆菌（P.rettgeri）及无恒变形杆菌（P.inconstans）。后根据表型和基因的差异研究，将变形杆菌属分为三个独立的菌属，即变形杆菌属、摩根氏菌属和普罗菲登斯氏菌属。将雷极氏变形杆菌和无恒变形杆菌引入普罗菲登斯菌属，而摩根氏变形杆菌变为摩根氏菌属。现在的变形杆菌属共包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、彭纳氏变形杆菌和产黏液变形杆菌4个种。最新又增加豪氏变形杆菌（P.hausersp.nov.），也就是原来普通变形杆菌的生物群3，与普通变形杆菌区别在于吲哚阳性、水杨苷利用和七叶苷水解阴性。与食物中毒有关的变形杆菌是普通变形杆菌、奇异变形杆菌和摩根变形杆菌。

变形杆菌为腐物寄生菌，在自然界分布较广，如水、土壤、腐败有机物及人和动物肠道中均有变形杆菌存在，所以食品受其污染的机会很多。据调查报告，动物带菌率为0.9%～62.7%、食品污染率为3.8%～8.0%，食品污染率高低与食品新鲜度、运输、贮存的卫生条件有密切关系，特别是不遵守操作规程，肉用动物屠宰解体时割破胃肠道等情况下，肉类及其产品污染率更高。被污染的食品在夏秋高温季节，变形杆菌大量生长繁殖，食用时极易引发食物中毒。

变形杆菌食物中毒也是一种比较常见的细菌性食物中毒，特别是熟肉类和凉拌菜，以及吃病死畜禽肉而引起变形杆菌食物中毒更常有发生。因为变形杆菌是条件致病菌，只在特定的条件下可引起人的原发性感染，是人类尿道感染最多的病原之一，也是伤口中较常见的继发感染菌。变形杆菌在一般情况下对人体无害，因此，仅从食品中检出变形杆菌没有什么意义，在检验时，除了进行一般的分离和鉴定变形杆菌外，还需做每克食品中变形杆菌的数量测定。

5.3.2.2 主要特征

① 形态及染色特征 本菌属为革兰氏阴性、两端钝圆的小杆菌、无芽胞、无荚膜、长1～3μm，宽0.4～0.6μm。有明显的多形性，有时呈球形、杆状、长而弯曲或长丝状，有周身鞭毛，活泼运动，如图5-3-6。

② 生长要求及培养特性 本菌为需氧或兼性厌氧菌，对营养要求不高，在普通培养基上生长良好。在10～45℃范围内均可生长，最适生长温度为34～37℃。

a.普通营养琼脂：变形杆菌在固体培养基上呈扩散生长，以间距性环形运动而形成不同层次的同心环，使琼脂表面形成一层波形薄膜，称为迁徙生长现象，这是本属菌生长的一个重要特征（图5-3-7）。如在培养基中加入0.1%石炭酸、0.4%硼酸、0.01%三氮化钠或将琼脂浓度提高到6%或将培养温度提高到40℃，可抑制其扩散生长，不出现迁徙生长现象，而得到单个菌落。

b.S.S琼脂：形成圆形、扁平、半透明、淡粉红色的小菌落，易与沙门氏菌等相混淆。

c.肉汤培养基：呈均等混浊生长，表面有菌膜。

在血琼脂平板上有溶血现象。能迅速分解尿素。

③ 生化特性 本菌属在鉴定上具有重要意义的有苯丙氨酸脱氨酶为阳性，能迅速分解尿素（2～4h），普通变形杆菌和奇异变形杆菌能迅速产生大量硫化氢，明胶液化明显。各种变形杆菌的主要生化特性见表5-3-7。

5.3.2.3 抵抗力

本菌抵抗力中等，与沙门氏菌类似，对巴氏灭菌及常用消毒药敏感，对一般抗生素不敏感。

5.3.2.4 致病性

变形杆菌属能在人体内不同部位致病。侵袭因子包括菌毛、鞭毛、外膜蛋白、脂多糖、荚膜抗原、脲酶、免疫球蛋白A蛋白酶、溶血素、氨基酸脱氨酶等多种因子，其最重要的特性迁徙生长能够使其定居并存活于更高级组织。变形杆菌的毒力因子及致病作用见表5-3-8。

（1）中毒过程及表现

变形杆菌食物中毒分为急性胃肠炎型和过敏型中毒两种。

急性胃肠炎型中毒 是由于大量变形杆菌随同食物进入胃肠道，并在小肠内繁殖引起感染过程。同时，变形杆菌可以产生肠毒素，肠毒素为蛋白质和碳水化合物的复合物，具有抗原性。由肠毒素引起中毒性胃肠炎。变形杆菌食物中毒潜伏期短，发病快，一般为3～5h，最短者仅1h。主要表现为恶心、呕吐、腹痛剧烈如刀割、腹泻、头痛、发热、全身无力等。腹泻一日数次至数十次。多为水样便，有恶臭，少数带黏液。病呈较短，一般为1～3d。1997年6月山东黄岛某企业职工食堂因被奇异变形杆菌污染的凉拌鸡胗引起食物中毒，就餐3938人，发病3528人。

过敏型中毒主要是因为摩根变形杆菌产生很强的脱羧酶，使食品中的组氨酸脱羧形成组胺。如在微酸性（pH 5～6）的条件下，鱼肉中的游离组氨酸即可生成组胺。摩根变形杆菌可引起过敏反应，潜伏期一般为30～60min，也可短至5min或长达数小时。主要表现颜面潮红、酒醉状、头痛、血压下降、心搏过速等。有时也伴有发热、呕吐、腹泻等症状，多在12h内恢复。水产品引起这类中毒较多，主要是由于摩根变形杆菌在微酸性（pH5～6）的条件下，鱼肉中的游离组氨酸被细菌脱羧酶作用，产生组胺。当组胺积蓄到一定量时，人食后即发生过敏性食物中毒。

（2）基因组

目前关于变形杆菌属全基因组研究的相对较少，该菌属还没有菌株完成全基因组的序列测定。奇异变形杆菌是引起尿路感染的主要细菌，研究人员分离编码奇异变形杆菌的菌毛基因PMF，并进行DNA测序，PMF长5655bp，有五个多肽，分别是PmfA（18921u）、PmfC（93107u）、PmfD（28208u）、PmfE（38875u）、PmfF（19661u），在序列中的调节基因或调节元素还没有证明。PMF基因簇具备很多其他肠道菌菌毛基因的共同特征，但也有其独有的特征。

普通变形杆菌的三个菌株的16S rRNA基因已完成测序，利用16S rRNA基因测序结果进行系统发生分析是非常好的分类方法，详细资料见GenBank。

（3）毒素

变形杆菌可以产生肠毒素。可引起中毒性胃肠炎。肠毒素具有抗原性。彭纳氏变形杆菌能产生一种钙依赖性溶血素，在多数临床分离株中溶血素在对数生长早期分泌于培养基中，能裂解几种动物包括人的红细胞及人的嗜中性粒细胞和人胚胎肺纤维原细胞，该溶血素是一个107ku的蛋白，与大肠杆菌溶血素同样大小，能与大肠杆菌溶血素HlyA抗血清反应，由于其与大肠杆菌毒性因子溶血素的大小、抗原性和作用范围类似，可以确定彭纳氏变形杆菌HlyA是该菌的重要毒性因子。

LPS作为细菌的内毒素是革兰氏阴性菌的致病因子，可引起广泛的致病作用，如发热，低血压、血栓和致死性休克，内毒素在细菌的复制、裂解死亡过程中能从细菌表面释放。变形杆菌的LPS除具有上述其他内毒素的生物学特性，已经证明S或R型变形杆菌的LPS能抑制小鼠肝脏细胞色素P450的活性。Larsson和Olling等还报道从慢性肾脏综合征病人的尿液中分离到R型黏附表型奇异变形杆菌17301，该菌能合成Rc化学型LPS，小鼠血液感染模型实验结果显示该菌能够在肾脏存活，导致感染者发病。

5.3.2.5 抗原构造

变形杆菌含有菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原。在Kauffmann-Perch二氏的抗原体系中，普通变形杆菌和奇异变形杆菌包括49个O抗原和19个H抗原分型。在49个O抗原中，17个是普通变形杆菌，27个是奇异变形杆菌，5个是两种菌共有的。最常见的是O₃、O₆、O₁₀的奇异变形杆菌，在19个H抗原中，最常见的是H₁、H₂、H₃。摩根变形杆菌属分为34个O抗原群和25个H抗原（表5-3-9）。

5.3.2.6 细菌学检测

① 分离培养 将检样接种于肠道选择培养基（S.S琼脂或D.C琼脂）及鉴别培养基（伊红美兰琼脂或麦康凯琼脂）平板各一个。并同时接种GN增菌液一管，于37℃培养18～24h后，再接种选择培养基和鉴别培养基。平板于37℃培养18～24h后，取出观察，变形杆菌在鉴别培养基上为无色、透明、蔓延生长或不呈蔓延生长，在选择培养基上形成孤立的菌落，有时边缘略呈扩散状态。

② 生化试验 用白金耳挑取可疑菌落接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，于37℃培养6～8h，苯丙氨酸斜面变为棕黑色，即为苯丙氨酸脱氨酶阳性。涂片镜检为革兰氏阴性菌，即认为变形杆菌，再进一步做生化反应，以鉴定其菌属。

在高成本的商品化鉴定方法中，点滴实验是既经济有效又快速的方法，在羊血琼脂平板上游散生长的菌落且氧化酶阴性，如果吲哚点滴试验反应阴性，培养物是奇异变形杆菌或彭纳氏变形杆菌的可能性很高；进一步区分这两个菌属，鸟氨酸脱氢酶阳性的是奇异变形杆菌；如果吲哚点滴试验苯丙氨酸脱氨酶是阳性培养物很有可能是普通变形杆菌。在多数情况下，快速点滴试验鉴定后不需要进行其他鉴定。近些年国家没有制定变形杆菌检测标准，国家质检总局《WS/T 9—1996变形杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》时间也很久远。

目前国内外商品化自动或半自动的鉴定系统产品较多，其中Vitek产品和Biolog系统联合使用可完成普通变形杆菌和彭纳氏变形杆菌的鉴定。还有资料报告，利用商业化的鉴定系统进行三个变形杆菌菌属鉴定，报告准确率100%的有Crystal ID-E/NF，GNI，GNI+，API 20E及Rapid Neg ID3系统，报告95%准确度的是 Rapid Neg ID3，97%准确度的是 Vitek GNI 卡，因为这些系统需要酶作底物，在实验室检验不可能达到完全精确，有时可能会有小的误差。

③ 血清学检查 目前仅普通变形杆菌及奇异变形杆菌有统一分型方法，而其他变形杆菌尚无统一方法。进行血清分型时，用已知的标准血清进行血清分型，用白金耳挑取细菌纯培养物进行玻片凝集反应，根据血清凝集情况，查对抗原表判定菌落。

④ 变形杆菌数的测定 将检样制成悬液，再以无菌生理盐水按原检样量稀释成1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000等各种稀释度。分别吸取每种稀释度的悬液0.1mL，接种于琼脂斜面底部凝集水内，切勿接触培养基表面。经37℃培养24～48h，观察生长情况。变形杆菌可自下向上弥漫生长，以出现生长的最高稀释度乘以10，即为每克检样中变形杆菌的最近似数。

⑤ 动物试验 将可疑检样和分离的变形杆菌培养物，分别饲喂小鼠或豚鼠、家兔等，观察动物是否发病，如寒颤、竖毛、腹泻等。

此外，各国研究人员还建立了一些该菌属的分子生物学鉴定和分型方法，在对一些已知的普通变形杆菌和奇异变形杆菌DNA测序的基础上选择β内酰胺酶和16S rRNA作为靶基因扩增片段，发展了变形杆菌多重PCR检测方法。Sabbuba等（2003年）用脉冲场电泳NotI-PFGE分子分型技术对医院环境和病人中分离的54株奇异变形杆菌进行分型，有52株有不同的脉冲型，与经典的Dienes分型法进行比较发现，NotI-PFGE技术有更强的区分能力。

5.3.2.7 食品生产的综合控制

变形杆菌在生产上的综合控制与其他肠杆菌属的控制方法相近，水产品引起变形杆菌食物中毒较多。国外有研究证明Grovac方法在鲶鱼生产过程中可以有效减少腐败菌和致病菌的数量（也包括变形杆菌），Grovac方法包括使用含有维生素C和氯化钠的溶液在生产过程中进行产品处理，产品进行抽真空包装等，试验结果表明这些措施在工厂生产过程中可有效减少腐败微生物和肠道致病菌的数量，延长食品货架期，微生物学监测数据可作为危害分析和关键控制过程的主要控制点。还有人提出良好农业实践的方案（Good Agriculture Practices）用于控制食品中变形杆菌的污染，主要包括危害分析，确定可能存在的问题，制定程序文件并培训操作者正确工作等。另外，快速、准确的食品检测和监测系统也是这一计划的一部分。

5.3.2.8 疫苗研制

奇异变形杆菌能引起尿路感染（UTI），能形成尿路结石，而尿素酶阴性的奇异变形杆菌突变株不能形成尿路结石且很少在肾脏定居，为此研制开发以一种奇异变形杆菌的表面黏附素MR/P纤毛为抗原的疫苗是很有希望的疫苗候选株，用于防止变形杆菌定居和尿路结石形成。

5.3.3 致病性大肠杆菌（Pathogenic E.coli） 

5.3.3.1 食品卫生学意义

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）通常简称为大肠杆菌，它主要寄居于人和动物的肠道内。由于人和动物活动的广泛性，决定了本菌在自然界分布的广泛性，在水、土壤、空气等环境都不同程度的存在。它属于条件致病菌，其中有些血清型能使人类发生感染和中毒，一些血清型能致畜禽疾病。致病性大肠杆菌是指能引起人和动物发生感染和中毒的一群大肠杆菌。致病性大肠杆菌与非致病性大肠杆菌在形态特征、培养特性和生化特性上是不能区别的，只能用血清学的方法根据抗原性质的不同来区分。致病性大肠杆菌根据其致病特点进行分类，目前分类方法尚不统一，一般被分为六类：肠产毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli，EIEC）、肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）、肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）、肠黏附性大肠杆菌（Enteroadhesive E.coli，EAEC）和弥散黏附性大肠杆菌（Diffusely adherent E.coli，DAEC）。

致病性大肠杆菌主要是通过牛奶、家禽及禽蛋、猪、牛、羊等肉类及其制品、水产品、水及被该菌污染的其他食物导致人们的食物感染与中毒，致病的大肠杆菌常见的血清型较多，其中较为重要的是EHEC O157∶H7，属于肠出血性大肠杆菌，能引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎（HC）和溶血性尿毒综合征（HUS）等全身性并发症。据美国疾病控制中心（CDC）估计，在美国每年约2万人EHEC O157∶H7引起发病，死亡率可达250～500人。近年来在非洲、欧洲、英国、加拿大、澳大利亚、日本等许多国家均有EHEC O157∶H7引发的感染中毒，有的地区呈不断上升的趋势，我国自1987年以来，在江苏、山东、北京等地也有陆续发生O157∶H7的散发病例的报导。

健康人肠道致病性大肠埃希氏菌带菌率一般为2%～8%，高者达44%；成人肠炎和婴儿腹泻患者的致病性大肠埃希氏菌带菌率较成人高，为29%～52.1%，饮食业、集体食堂的餐具、炊具，特别是餐具易被大肠埃希氏菌污染，其检出率高达50%左右，致病性大肠埃希氏菌检出率为0.5%～1.6%。食品中致病性大肠埃希氏菌检出率高低不一，低者1%以下，高者达18.4%。猪、牛的致病性大肠埃希氏菌检出率为7%～22%。

5.3.3.2 主要特征

（1）形态及染色特征

本菌属为两端钝圆，散在或成对的中等大肠杆菌，长2～3μm，宽0.4～0.6μm，多数菌株有5～8根周生鞭毛，运动活泼，周身有菌毛。少数菌株能形成荚膜或微荚膜，不形成芽胞。对一般碱性染料着色良好，有时菌体两端着色较深，革兰氏染色阴性（图5-3-8）。

（2）生长要求及培养特性

大肠杆菌为需氧或兼性厌氧菌，对营养要求不高，在普通培养基上能良好生长。15～42℃能发育繁殖，最适生长温度为37℃，最适生长pH值为7.2～7.4。

① 普通琼脂 培养18～24h，形成凸起、光滑、湿润、乳白色，边缘整齐，直径2～3mm的圆形菌落。

② 血液琼脂 菌落形态与普通琼脂上的菌落相似，稍大，部分菌株在菌落周围产生β型溶血环（图5-3-9）。

③ 伊红美兰琼脂 菌落形态同普通琼脂上的菌落，呈紫黑色表面带金属光泽。

④ S.S琼脂 本菌多数不生长，少数生长菌株，菌落较小，因发酵乳糖产酸，产生红色菌落。

⑤ 普通肉汤 呈均等混浊生长，很少形成菌膜，管底有黏性沉淀，沉淀振摇后，容易分散，培养物有特殊的粪臭味。

EHEC O157∶H7在山梨醇/麦康凯琼脂（SMAC）培养基上，长成白色半透明表面光滑的菌落。在加钙的绵羊血液琼脂平板（WSBA-Ca）上，经37℃培养18～24h，可见小而混浊的溶血环。

（3）生化特性

本菌属基本生化特性见表5-3-10。

本菌属细菌能发酵多种糖类产酸产气，也有不产气的生化型，大多数菌株可迅速发酵乳糖，仅极少数迟缓发酵或不发酵，约半数菌株不分解蔗糖。

5.3.3.3 抵抗力

大肠埃希氏菌在自然界生存力较强，在土壤、水中可活存数月，在寒冷干燥的环境中可存活较久，而在潮湿温暖的环境中，存活不到1个月。对热抵抗力不强，60℃加热30min即可被杀死。本菌培养物在室温中可存活数周，如密封者在黑暗室温（20～22℃）中至少能保存1年，冻干菌种置低温（-20℃以下）至少能活10年。对常用消毒剂抵抗力不强，5%～10%漂白粉、3%来苏儿、5%石炭酸等均能迅速杀死大肠杆菌，对氯很敏感，在含有0.2mg/L游离氯的水中，可很快死亡。对强酸和强碱较敏感。本菌对抗菌药物的敏感性日益降低，耐药菌株也越来越多，不同国家和地区、不同动物源性大肠杆菌菌株对抗生素类药物的敏感性也不同。

5.3.3.4 致病性

大肠杆菌的病原性是由许多致病因子综合作用的结果，它们包括黏附因子、宿主细胞的表面结构、侵袭素和许多不同的毒素及分泌这些毒素的系统。

（1）中毒表现

① 急性胃肠炎型 潜伏期一般为10～15h，短者6h，长者74h。由ETEC所致，是致病性大肠埃希氏菌食物中毒的典型症状，比较常见。主要表现为腹泻、上腹痛和呕吐。粪便呈水样或米汤样，每日4～5次。部分患者腹痛较为剧烈，可呈绞痛。吐、泻严重者可出现脱水，乃至循环衰竭。发热（38～40℃）、头痛等。病程3～5d。

② 急性菌痢型 潜伏期48～72h，是由EIEC型引起，主要表现为血便、脓血、脓黏液血便，里急后重、腹痛、发热，部分病人有呕吐。发热，38～40℃，可持续3～4d。病程1～2周。

③ 出血性肠炎型 潜伏期一般为3～4d，短者1d，长者8～10d。主要由O157∶H7引起，主要表现为突发剧烈腹痛、腹泻，先水样便后血便，甚至全为血水。也有低热或不发热者。严重者出现溶血性尿毒综合征（HUS），血小板减少性紫癜等，老人和儿童多见。病程10d左右，病死率为3%～5%。

（2）基因组

目前已经完成了出血性大肠杆菌EHEC O157：H7菌株EDL933和Sakai以及尿路感染大肠杆菌UPEC菌株CFT073染色体基因组测序。

EHEC O157：H7菌株EDL933基因组序列于2001年公布，O157∶H7 EDL933是1982年从Michigan地区暴发病例中分离出的，与大肠杆菌K12基因组比较，在大肠杆菌O157∶H7 EDL933中发现1387个新的基因。其中包括一些毒力因子，几个前噬菌体和其他的新功能的基因（图5-3-10）。

日本宫崎医科大学报道了EHEC O157∶H7分离株Sakai的全基因序列，Sakai是从1996年日本大规模爆发EHEC O157感染中分离到的。基因组全长5498450 bp，基因组上共有24个前噬菌体和前噬菌体序列。基因组共有5301个蛋白编码基因，7个拷贝的rRNA、102个tRNA、1个mRNA及13个小RNA。该分离株携带两个质粒，pO157和pOSAKI。这个菌株和EDL933一样能产生两种志贺毒素Stx1和Stx2。

UPEC菌株CFT073全基因组序列与大肠杆菌K12及EDL933基因组比较，CFT073缺乏Ⅲ型分泌系统的基因，缺乏噬菌体或质粒编码的毒素基因，但有丰富的菌毛黏附素自动转运系统、离子吸收系统及重组酶基因。

（3）致病岛

肠出血性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌的特征性病变是“黏附与脱落病变”（Attaching and effacing，A/E），引起这种病变的基因基础是由于均具有被称之为肠细胞脱落位点的致病岛（The Locus of Enterocyte Effacement，LEE）。LEE致病岛是位于染色体上的编码毒力因子的基因群，它含有编码A/E损伤的所有基因以及其他一些毒力基因。LEE含有的基因主要包括以下几种类型：编码Ⅲ型分泌系统（esc或sep），分泌型蛋白质（esp）及其分子伴侣，外膜蛋白紧密素（eae）和紧密素易位受体（tir）等基因。

Elliott等测出了EPEC E2348/69菌株LEE致病岛的全序列，并进行了初步分析。详细的资料见GenBank（登录号AF022236）和分子微生物的网站（http://www.blackwell-science.com/products/journals/mole.htm）。E2348/69菌株的LEE全长有35624bp，G+C含量为38.36%，这比大肠杆菌全基因组G+C含量50.8%低得多。LEE共含有41个开放性阅读框（open reading frames，ORFs），至少有4个多顺反子（polycistronic operon）控制这些ORFs。

Perna等还报道了EHEC O157：H7 EDL933 LEE致病岛的全序列有43359bp（GeneBank登录号AF071034），G+C含量为40.91%，共含有54个开放性阅读框。对这两个菌株的LEE进行比较分析，发现EHEC中有13个命名为933L的ORF属于P4前噬菌体家族，EPEC则不含这些ORF。其余的41个ORF这两个菌株相同。二者LEE致病岛上的基因有95%的同源性（图5-3-11）。

EPEC E2348/69菌株的LEE在其两端缺少直接重复序列，也没有明显的噬菌体序列。EHEC O157∶H7的LEE在一端含有一个溶源性噬菌体，但后者很可能是在LEE插入到细菌染色体之后才整合到LEE中。

LEE致病岛上的主要致病基因：

① eae基因 引起A/E损伤最主要的一个蛋白就是由eae（E.coliattaching and effacing）基因编码，eae基因位于LEE致病岛上，编码一个94000～97000u被称为紧密素（Intimin或Eae）的外膜蛋白，是肠道黏附因子。紧密素黏附是由紧密素介导的细菌与肠上皮细胞膜紧密结合，大肠杆菌EHEC O157特征性A/E病变的发生，紧密素起非常重要的作用。

② tir基因 tir基因紧位于eae前面，它编码Tir蛋白，即紧密素易位受体（translocated intimin receptor）。最初人们把Tir当作是宿主细胞膜上的一个酪氨酸磷酸化的蛋白质而叫做“Hp90”。后来发现Tir是由细菌LEE编码的一个分子量为90ku的细菌蛋白质，它由Ⅲ型分泌系统分泌后经转运进入上皮细胞细胞膜，插入到膜蛋白中，然后经过磷酸化后作为紧密素的受体。

在tir和eae基因之间是cesT（以前叫orfU）基因，它编码着Tir蛋白的一种分子伴侣蛋白（chaperone）。cesT在所有已知的引起A/E损伤的病原菌中都具有高度的保守性，这可能是因为在此阅读框内具有eae的转录起始位点。

③ 编码Ⅲ型分泌系统及其分泌蛋白的基因 Jarvis等报道EPEC LEE致病岛编码一种Ⅲ型蛋白质分泌系统，它与许多人、动物或植物的革兰氏阴性病原菌的蛋白质分泌系统相似。Ⅲ型分泌系统是一个由多组分蛋白复合体形成的跨膜孔状通道，它是许多病原菌用来分泌毒力蛋白，或把这些蛋白直接注入宿主细胞以起始生化信息传导的结构。Ⅲ型蛋白质分泌系统可以分泌和转移一些主要的毒力决定因子。

EPEC中编码Ⅲ型分泌系统的一系列基因位于LEE的左侧，这些基因最初被称之为sep，但后来发现它有一个亚型与其他细菌的Ⅲ型分泌系统同源，因把此同源的亚型重新命名为esc。

在LEE致病岛上还有espA、espB、espD和espF基因，它们编码着Ⅲ型分泌系统分泌的蛋白质，espA、espB和espD中任何一个基因突变都会使菌株丧失A/E表型，它们是引起A/E损伤所必需的。当细菌黏附肠上皮细胞以后，EspA、EspB和EspD中的一种或几种蛋白质可以经过Ⅲ型分泌系统进入肠上皮细胞。这三种蛋白质参与激活宿主上皮细胞信号传导途径，细菌与上皮细胞的紧密黏附，以及A/E损伤的形成。espA、espB和espD基因突变菌株不能产生致A/E损伤的信号传导。

LEE致病岛除含有编码功能性的Ⅲ型分泌系统，分泌型蛋白质和紧密素的基因外，还含有一些以前不知道的基因，这些基因可能编码一些新的蛋白质，它们参与形成Ⅲ型分泌通道，形成新的分泌型蛋白质，分子伴侣，调节子或抑制子等。

（4）LEE致病岛的调节

A/E大肠杆菌如果要在肠上皮细胞表面形成A/E损伤，就需要LEE致病岛上的所有基因在环境因素的刺激下能够协同表达。但直到现在，人们对EPEC和EHEC LEE致病岛表达的调控仍知之甚少，现在认为per对EPEC LEE致病岛上的某些基因具有调节作用，它对ler（LEE-encoded regulator）调节基因具有正调节作用，可激活ler的转录，ler是由LEE致病岛编码的一个转录活化因子。LEE致病岛的基因可分为四个多顺反子，分别为LEE 1、LEE 2、LEE 3和LEE 4，per只能直接激活LEE 1的表达，LEE 1中含有ler基因，ler基因产物转而又激活LEE 2、LEE 3和LEE 4的表达。这样，在EPEC中就形成了一个对LEE致病岛的级联调节形式。但是对于EHEC LEE致病岛的调节方式目前还不太清楚，因为在EHEC中并没有发现per或其类似物的存在。

（5）常见的致病性大肠杆菌的致病特征

① 产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coil，ETEC）产肠毒素大肠杆菌ETEC主要对人群致病，是发展中国家儿童和旅游者腹泻的主要致病因素之一，污染的水和食物是主要感染源。在志愿者实验中给予10⁸CFU口服剂量ETEC活菌就可导致感染者高发病率。感染的临床症状有些表现为温和型腹泻，也有些发展为严重的霍乱样症状。该菌的两个主要毒力因子是黏附素和肠毒素。最常见的黏附素是菌毛，ETEC黏附并定居于肠道黏膜首先需要通过菌毛介导，ETEC菌毛致病有重要特征，即有种特异性，如表达K99的ETEC菌株对牛、羊、猪致病，表达K88的ETEC可引起猪致病，含有决定定居的菌毛CFA的ETEC分离株对人致病。

ETEC感染的致病机制在过去的20年间被广泛地研究，ETEC导致感染者腹泻主要通过肠毒素的作用。肠毒素按照抗原和生物学特性不同可分成不耐热肠毒素（Heat labile enterotoxin，LT）和耐热肠毒素（Heat stable enterotoxin，ST），ETEC菌株有些只表达LT或只表达ST，或者两者都表达。大肠杆菌的LT是低聚物毒素，其结构和功能与霍乱毒素（CT）相近，它们之间存在许多共同特性，如全毒素的结构、蛋白序列、主要受体特性、酶活性及在动物和细胞培养实验中的特性等，但这两种毒素产生和分泌过程及辅助T淋巴细胞反应却不同。LT可分成两个血清组LT-Ⅰ和LT-Ⅱ，大肠杆菌LT-Ⅰ对动物和人均致病，LT-Ⅱ主要对动物致病，很少对人致病，它们之间没有免疫交叉反应。ST可激活小肠上皮细胞的鸟苷酸环化酶，使胞内cGMP增加，在空肠部分改变液体的运转，使肠腔积液而引起腹泻。ST与霍乱毒素无共同的抗原关系。

长期以来ETEC检测主要针对其肠毒素LT或ST进行检测。最早检测ST通过兔结扎回肠实验检测，后来由于该方法检测费用高且一直没有形成标准而改用乳鼠实验替代。ST免疫学分析测定发展了放射免疫和酶联免疫分析方法（ELISA），这两种方法与乳鼠实验比较符合率非常好，而且操作简单。传统的LT的检测利用Y1肾上腺细胞和CHO细胞培养技术，ETEC培养上清使Y1肾上腺细胞变圆，CHO细胞拉长。ETEC分子生物学诊断主要发展了编码LT和ST的DNA探针用于环境和粪便样品的检测，LT多聚核苷酸探针敏感性和特异性好，结合Blue Gene；Gibco-BRL检测系统利用菌落杂交进行鉴定；而ST探针由于基因片段小，敏感性和特异性较差，应用相对较少。由于该菌定居因子的种类比较多，变异体也较多，目前用于检测定居因子的探针检测效果还不够理想的。

② 肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）肠致病性大肠杆菌EPEC是发展中国家婴儿腹泻的主要致病菌，其流行病学的最显著的特征是EPEC主要引起2岁以下的儿童发病，成人感染剂量则需要达到10⁸～10¹⁰CFU。流行病学研究发现一些EPEC感染的病人有临床症状，一些感染携带病人该菌却不表现临床症状，还有病人在症状停止后两周粪便中还能分离到EPEC。EPEC主要引起急性腹泻，也有报道该菌可引起慢性腹泻，Rothbaum等就报道病人感染病程从21～120d。该菌主要组织病理学特征是能在感染肠上皮细胞或在组织培养细胞表面形成特征性的组织病理学损伤，这种损伤叫作黏附与脱落（attaching and effacing，A/E），其病理学变化是细菌与肠上皮细胞紧密黏附，肠微绒毛消失，并使细菌黏附部位的肠上皮细胞骨架发生改变，丝状肌动蛋白聚集等。引起A/E损伤最主要的一个蛋白就是由eae基因编码的被称为的紧密素（intimin）外膜蛋白，含eae基因的EPEC菌株能在肠黏膜产生典型的A/E损伤病变。此外，EPEC胞外分泌蛋白中至少有三种对A/E损伤形成非常重要，EspA（25ku），Esp（38ku）和EspD（40ku），EPEC菌株EspA、EspB或EspD基因突变后则丧失在上皮细胞产生信号转导的能力，不能形成A/E损伤。

许多EPEC菌株都携带一个EAF质粒，在该质粒bfp基因下游是一个转录调节子per，eae的表达由质粒介导的调节子per调节，per能增加染色体基因组转录。在EPEC菌株中per基因的一边是一个1kb限制酶切片段，可作为DNA诊断探针，广泛地用于该菌的检测。

EPEC检测也同其他病原菌一样主要依据其标志性特征，EPEC的重要特征是EPEC能致A/E损伤、含有EAF质粒且不产生志贺毒素。该菌表型检测通过荧光蛋白集聚试验FAS实验，利用HEp-2或HeLa细胞培养方法进行鉴定。电镜观察肠组织样本或培养的上皮细胞，特征是EPEC对HEp-2或HeLa细胞呈局灶性黏附。EPEC的基因型检测发展了DNA探针并建立了PCR检测方法，典型的EPEC含有eae基因能致A/E损伤。该菌携带EAF质粒，EAF探针或bfp序列检测阳性能够说明EAF质粒的存在，EAF探针已用于世界范围的流行病学调查中。当然在临床分离株中也分离到非典型的EPEC菌株，通常含有eae基因却没有EAF质粒。

③ 出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）出血性大肠杆菌主要包括O157∶H7、O26∶H11和O111∶MN。其中血清型O157∶H7是引起出血性结肠炎的主要致病菌。关于EHEC发病机理和流行病学的多数认识都来源于对该血清型的研究。

大肠杆菌O157∶H7感染暴发以食源性传播为主，水源性传播和接触传播也是重要的传播途径，有些暴发可以多途径并存。据报道，由于O157∶H7感染力强，100～200个O157细菌就能突破胃酸屏障，在肠道内大量繁殖，引起感染。而其他致病性大肠杆菌需要100万个细菌以上才能引起发病。流行病学研究资料表明，在家畜中，主要是反刍动物（牛、羊）被认为是天然带菌动物。但是，其具体传播途径是复杂多样的。感染人群中儿童和老年人最易发病且症状较为严重，容易并发溶血性尿毒综合征和血小板减少性紫癜。EHEC O157∶H7是EHEC的代表菌株，能引起出血性或非出血性腹泻，出血性结肠炎（HC）和溶血性尿毒综合征（HUS）等全身性并发症。其致病机制可分两个方面，黏附于上皮细胞产生A/E病变和产生志贺毒素Stx引起靶器官损伤。目前的研究证据表明，EHEC致病机理在很大程度上与EPEC相似，它们在基因结构上都有致病岛，都能引起特征性的黏附与脱落病变，因此将之统称为A/E大肠杆菌群。

EHEC O157∶H7的主要致病因子包括志贺毒素（Stx），LEE致病岛编码的黏附因子和溶血素（hemolysin）。近年来，大多数关于E.coliO157∶H7致病因子的研究多数集中于Stx，它由整合于基因组的原噬菌体编码，还有一些研究关于LEE致病岛和60-Mu质粒。

长期从事出血性大肠杆菌O157研究的Kaper等（1998）提出了A/E大肠杆菌致病作用的三步模型，第一步，局灶性黏附，细菌与细菌间借助与BFP菌毛黏着成簇，细菌与肠上皮细胞在BFP的参与下发生相互作用。第二步，细菌Ⅲ型分泌系统的基因被激活并表达相应蛋白。Tir蛋白通过蛋白通道进入上皮细胞并定位于细胞膜上，并引发一系列信号传导过程。第三步，紧密素介导的细菌与细胞间的紧密黏附，引发典型的A/E病变。

EHEC O157的检测已经发展了很多快速有效的检测方法，山梨醇/麦康凯琼脂（SMAC）实验证实是一种有效的EHEC O157分离培养基。该菌所产生的Stx毒素的检测有多种方法，其中较为简便的方法是乳胶凝集试验，目前国外（日本、美国等）有成套试剂出售，血清学检测对于流行病学调查来说是极为有用的。实验室血清学检测方法很多最常用的是ELISA法，所使用的抗原为全菌体抗原、LPS抗原、亲和蛋白抗原、Stx抗原等，利用这些抗原检测血清中相应抗体水平，进而了解本病的流行病学情况。对EHEC O157的检测和诊断，已建立了许多分子生物学方法，如利用Stx对Vero和Hela细胞的特征性细胞毒性作用，建立了毒素抗体中和试验，特异性诊断EHEC O157感染；针对stx基因、eae基因以及针对O157型特异性基因而发展起来PCR诊断技术和基因芯片技术；利用特异性噬菌体对大肠杆菌裂解特性，建立了EHEC O157噬菌体分型技术；根据大肠杆菌染色体组特定限制性酶切位点的分布特性，建立了脉冲场凝胶电泳（PFEG）分析技术；利用单克隆抗体建立的ELISA以及免疫磁性分离技术等。其中在EHEC O157诊断上应用最为广泛的是PCR诊断技术，采用多重PCR法，对靶位基因的选择上多集中于stx基因、eaeA基因、fliC（H7抗原）基因等，人们已经合成了许多特异性PCR引物。

④ 肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli，EIEC）1971年DuPont等最早在一个志愿者试验中发现侵袭性大肠杆菌EIEC能引起腹泻，该菌在发展中国家感染发病率相对较低。主要引起大龄儿童和成年人腹泻，有暴发流行的报道，已经暴发的EIEC感染通常是食物源性或水源性的，其症状主要表现为水样腹泻，少数人出现痢疾症状。该菌主要侵袭大肠上皮细胞，临床上表现出类似痢疾的症状。该菌生化特性与志贺氏菌接近，志愿者感染实验证明EIEC感染剂量高于志贺氏菌STEC。EIEC主要的毒力基因是编码Ⅲ型分泌系统蛋白的mxi和spa基因，该菌携带的与侵袭有关的质粒pInv，Nataro等克隆EIEC质粒中的sen基因，其编码一个63ku的蛋白，突变sen基因的菌株可引起致病菌肠毒素活性明显降低，这表明sen基因在该菌致泻过程中扮演重要作用。侵袭性大肠杆菌EIEC的某些血清型与痢疾杆菌有共同抗原，因此常易误诊为细菌性痢疾。

EIEC具有侵袭上皮细胞的能力，并在细胞间扩散，可引起豚鼠角膜炎，常用此方法检测大肠杆菌的侵袭力。与毒力相关的特征是在HeLa细胞单层中形成噬菌斑。

区分EIEC和志贺氏菌STEC制备的两个检测探针，探针pMR17选择了一个志贺氏菌质粒中17kb酶切片断；探针ial是EIEC pInv质粒中2.5kb HindⅢ片段，对EIEC菌株具有非常好的敏感性和特异性，但值得一提的是EIEC在体外保存和传代过程中会发生pInv质粒丢失，因此粪便样品通过探针进行检测应尽快进行。

⑤ 肠聚集性大肠杆菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）许多大肠杆菌能黏附于Hep2细胞，区分黏附典型的主要特征是：EPEC呈局灶性黏附（LA），非EPEC菌株呈现弥散性黏附（DA）。弥散型黏附又分成两类：聚集性黏附（AA）和弥散性黏附（DA），按此黏附类型进行分类的两类大肠杆菌分别是：肠聚集性大肠杆菌（enteroaggregative E.coli，EAEC）和弥散黏附性大肠杆菌（diffusely adherent E.coli，DAEC）。

肠聚集性大肠杆菌EAEC是一种新出现的肠道致病菌，主要发生于旅行者或发展中国家和工业化国家的地方性腹泻，EAEC感染后主要症状是长时间腹泻（≥14 d），有散发和暴发的报道。症状主要是呕吐和水样、黏液样腹泻，无发热症状。该菌通常不分泌肠毒素LT或ST，AA型能黏附于HEp2细胞，在感染病人和动物模型中进行检查其重要的组织病理学变化是EAEC菌株能增强黏膜肠液分泌。Tzipori等给猪接种EAEC菌，虽然没有腹泻症状，但所有动物都呈现不正常的黏液黏附到小肠上皮细胞，检查这些黏液存在大量的高密度聚集的细菌。动物实验还证实该菌感染后能导致回肠绒毛损伤，黏膜下层水肿，在体外组织培养试验发现毒素发挥作用需要编码黏附菌毛的基因和65Mu质粒。

关于EAEC致病的模型，有人提出三步致病模型：第一步，细菌黏附于肠内黏膜，AAF/I和AAF/II起主要作用，有利于最初的定居；第二步，黏液产生增多；第三步，细胞毒素产生，损坏上皮细胞。

EAEC感染的诊断通过分离大肠杆菌并在Hep2细胞黏附实验中证实是AA型黏附，也可以通过DNA探针鉴定。根据多数EAEC菌株都携带一个高度保守的大质粒，不同分离株这些质粒DNA序列比较发现它们之间有较高的DNA同源性，Baudry等选择质粒中一个1.0kb的Sau3a片段作为诊断探针，63株EAEC分离菌株（Hep2细胞黏附实验证实阳性）56株阳性（89%）。EAEC的毒性因子在被称作AggR的控制调节下，AggR控制黏附因子的表达，为此典型的EAEC菌的鉴定可以通过检测aggR基因。

⑥ 弥散黏附性大肠杆菌（Diffusely adherent E.coli，DAEC）弥散黏附性大肠杆菌DAEC最初指能黏附于Hep2细胞但不形成EPEC的微菌落型黏附的大肠杆菌，随着EAEC的发现，多数人认为DAEC是致泻性大肠杆菌的一个独立的类别。但目前对DAEC导致腹泻的病理特征了解得还很有限。最近在圣地亚哥一项调查中发现DAEC致病与年龄有很大关系，DAEC感染引起的腹泻从1～5岁儿童发生的危险较大，原因还不清楚。典型的DAEC菌株是含有AfaE-Ⅰ，AfaE-Ⅱ，AfaE-Ⅲ，AfaE-Ⅴ，Dr，Dr-Ⅱ，F1845等鞭毛基因和NFA-I黏附素（Afa/Dr DAEC）的大肠杆菌；这些菌株可能连接于人的衰变加速因子（DAF）[Afa/Dr（DAF）亚属]和癌胚抗原（CEA）。DAEC菌的检测通常通过Hep2细胞黏附实验，呈DA型黏附。Bilge等克隆的该菌表面鞭毛基因F1845，该基因在一些临床分离株的DAEC菌株中均有发现，为此DAEC DNA探针的研究主要发展了对表达F1845鞭毛必需的daaC基因，用此探针进行DAEC检测阳性符合率能达到75%。

总之，随着上述六类大肠杆菌的研究不断深入，对其毒力因子和致病机制的研究不断取得新的进展，发展了很多快速有效的分子生物学诊断方法，这些工作取得的成绩有利于更好地进行流行病学监控，在预防和治疗这些疾病方面有重要意义。

5.3.3.5 抗原构造

大肠杆菌的抗原比较复杂，主要包括菌体抗原（O），鞭毛抗原（H）和包膜抗原（K）三部分组成。

① O抗原 大肠杆菌的菌体抗原，为耐热的多糖-磷脂-蛋白质复合物，加热100℃或121℃加热2h均不能破坏其抗原性。具有抗乙醇和稀酸的作用。致病性大肠杆菌菌株常与其O群抗原密切相关，也就是O抗原是大肠杆菌血清分群的基础。因而在大肠杆菌鉴定时O抗原显得比H抗原和K抗原更为重要。目前已发现本菌共有164种O抗原，但排序列至171。O抗原以阿拉伯数字表示。

② H抗原 即鞭毛抗原，是一种不耐热的蛋白质抗原。一般一种大肠杆菌只有1种H抗原，没有鞭毛或失去鞭毛的变种，也就失去了H抗原。经水浴加热60℃以上或用乙醇即可逐渐被破坏。H抗原共有57种，但排序到59，其中H₁₃和H₂₂鉴定为枸橼酸杆菌而被删除。

③ K抗原 系包于菌细胞外部对热不稳定的多糖或蛋白质物质，存在于荚膜、被膜或菌毛中，又称为荚膜抗原、被膜抗原、表面抗原。K抗原是大肠杆菌几种表面抗原的总称，由于K抗原存在于O抗原外周，所以，凡是具有K抗原的大肠杆菌均可抑制活菌相应O血清的凝集性。根据K抗原的物理性质，将K抗原又分为L、A和B三种。L和B是不耐热抗原，具有L、B抗原的菌株不具荚膜，A抗原是耐热抗原，具有A抗原的菌株则具有荚膜。

④ L抗原 对热敏感100℃加热1h，即可破坏其抗原性，并失去在相应抗体中的凝集性，主要存在于细胞被膜中，偶见于荚膜。

⑤ A抗原 加热100℃1～2.5h，或121℃加热2h，可破坏其抗原性和O不凝集，而仍具有相应抗体的结合能力。此抗原存在于荚膜中。

⑥ B抗原 100℃加热1h即能破坏其抗原性和与相应抗体的凝集性，它是荚膜或被膜中的成分。

O、K、H抗原是大肠杆菌血清学分型的基础，按不同的组合方式组成不同的大肠杆菌血清型，大肠杆菌的抗原式如O₈∶K₂₅∶H₉。

5.3.3.6 毒素

大肠杆菌在致病过程中起重要作用的是其产生的毒素。这些毒素包括内毒素、肠毒素、细胞毒素等。

① 内毒素 由脂多糖与蛋白质复合而成，分子量大于100000Da，耐热160℃、2～4h才被破坏，毒性较小，200～400μg才能杀死小白鼠，无特异性，具有免疫原性，经甲醛处理后，不能变成类毒素。该毒素具有多种毒性反应，如致热性，引起人和动物发热；白细胞增多（小剂量）或减少（大剂量）；血糖增高，损伤微循环以及引起小白鼠死亡。

② 肠毒素 是某些大肠杆菌在生长繁殖过程中产生并释放出来的一种外毒素，按肠毒素对热的耐受力分为耐热性肠毒素（ST）和不耐热肠毒素（LT）。

a.耐热性肠毒素（ST）：对热稳定，100℃加热30min不被破坏，仍保持其活性，是由分子量小于5000Da的多肽组成，可透析，对酸、胰酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶均有抗性，无免疫原性或免疫原性极弱。

b.不耐热性肠毒素（LT）：对热不稳定，60℃加热30min即被灭活。分子量为80000Da或86500Da的蛋白质，不能透析，不易分离，有抗原性。硫酸铵或丙酮能使其沉淀，经福尔马林处理，可变成类毒素。LT主要刺激肠腺使其分泌能力增强，作用缓慢持久，可导致肠管中液体缓慢蓄积。与霍乱弧菌的肠毒素（CT）极其相似，并具有共同的抗原关系。

③ 细胞毒素 它是一种能致Vero细胞病变的毒性物质，故称Vero细胞毒素（VT），因它的毒性作用相似于痢疾志贺氏菌毒素，故又称志贺氏样毒素（SLT）。后来在人的EHEC O157∶H7菌株中又发现一种对Hela和Vero细胞均有毒性的细胞毒素，亦称志贺氏样细胞毒素（Stx）。此毒素对肾上腺细胞及中国地鼠卵巢细胞（CHO）无毒性，不引起兔回肠的积液效应，不耐热，98℃加热15min即被破坏，有抗原性，但与肠毒素不同，见表5-3-11。

此外，大肠杆菌的某些菌株还能产生血管渗透因子（VPF），大肠杆菌神经毒素β-溶血素等。

5.3.3.7 细菌学检测

① 常规检测 大肠杆菌普遍存在于人和动物肠道内，不断地随粪便排出体外，成为环境和食品的污染源。为此，世界各国都确定了以大肠杆菌、大肠菌群、粪大肠杆菌作为食品和生活饮用水中粪便污染的指标菌，并制定了国家的统一检验方法及各种食品和饮用水的卫生指标，以判定食品和水的卫生状况。目前我国国家标准中大肠杆菌的检测方法主要有：《食品中大肠菌群的测定方法》GB 4789.31—2013（图5-3-12）；食品安全国家标准《食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验》（GB 4789.31—2013）。

② 分子生物学检测方法 基因探针和PCR技术广泛用于致病性大肠杆菌的快速检测中，用LT、ST-Ⅰ、ST-Ⅱ三种基因探针可进行分子流行病学调查和菌株肠毒素的鉴定。可替代其他繁琐的检测和动物模型毒素检测方式。通常有两种方法进行核酸探针鉴定：第一种方法将纯培养物点种到琼脂平板，每个平板上点种30～50个，转膜后用特异性探针进行菌落杂交。该方法的缺点在于如果在分离步骤没有得到致病菌的纯培养物，则检测不到正确的阳性结果；第二种方法直接将粪便样品点种在置于培养平板的硝化纤维素膜上，过夜培养后，用滤膜进行菌落杂交。该方法致病性大肠杆菌不必从粪便中分离出来。但存在大量的杂菌影响检测的敏感性。这种方法不分离致病菌的纯培养物，为此必要时还需要进行表型鉴定。在临床诊断上应用最为广泛的是PCR技术，它是一种简便、快速、敏感性高的鉴别和诊断方法。EHEC O157的PCR诊断一般采用多重PCR方法。Holland等研究了粪便中检测EHEC O157的多重PCR方法，在样品处理上采用了QIAampDNA minKit和细菌快速富集法（In-house enrichment method）可以在8h之内完成EHEC O157鉴定，其灵敏度为10⁴～10⁵CFU/g。用多重PCR检测，同时检测溶血素Hly和肠毒素SLT特异性基因，能快速检测和鉴定EHEC菌株，并与EPEC区分开来。多重PCR检测的主要毒力基因还有aggR、It、st、vt、eaeA、astA、invE等基因。

基因芯片：Chizhikov等将6个编码大肠杆菌抗原和毒力的特异基因探针（EaeA，SltⅠ，SltⅡ，FliC，RfbE，IpaH）点样在玻片上，取多重PCR扩增产物与之杂交，用于同时检测和鉴定食物中毒相关的肠道病原体，该芯片可同时检测15种沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌的毒力因子。

③ 其他检验方法 检测大肠杆菌及其肠毒素的新技术、新方法很多，如用K₈₈单抗血清对粪中K^＋₈₈菌检出率比常规培养法提高的一倍，最小检测菌量为10000CFU/mL。987P酶标单抗对粪便和肠内容物最小检出菌量为2000CFU/mL，但这些方法在实际应用中各有利弊。对致病性大肠杆菌毒力基因检测过去多用动物或细胞培养测定，现可用其单抗以多种免疫学手段检出。如用免疫磁分离法检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157∶H7，可提高了大肠杆菌O157∶H7感染病例的检出率。

据报道，2004年10月，美国佛罗里达大学科学家使用纳米粒子技术，开发出一种新的大肠杆菌检测法，即使样本里只有一个大肠杆菌也能检测出来，整个过程只需要20min。

④ 分子流行病学分型方法 血清型分型技术：按照常规方法主要对O、K、H抗原进行鉴定。分子生物学分型技术：用核糖体分型和脉冲肠电泳技术（PFGE）分型，可对急性分泌型腹泻病人中分离的ETEC病原菌分析，美国国家公共卫生实验室已完成了PFGE的标准化流程的制定。随机引物扩增DNA多态性（RAPD）和扩增片段长度多态性（FAFLP）分析分型技术也可用于致病性大肠杆菌的分型。

5.3.3.8 食品生产的综合控制

（1）通过免疫带菌动物以减少病原菌的传播

牛和其他动物（包括野生鹿）是出血性大肠杆菌（EHEC）的主要携带者，它们成为该菌传播人类的主要来源。从流行病学考虑，有效的动物疫苗接种必然缩短细菌定居时间，直接控制疾病的方法是对牛及其他反刍动物进行免疫，这一防治策略将解决问题的重点放到了带菌动物身上，而不是像以前只考虑对人类实施免疫，这种观点从流行病学和公共卫生角度来讲在理论上有很多优点，因为这样动物性食品的最终产品将更加安全，对于食品工业来说是非常积极的。另外，通过大面积免疫肉用动物来防止食源性疾病，还很少有成功的先例，进行这方面的尝试无疑对于预防本疾病和其他食物源性疾病的传播意义重大。但是有几方面问题需要考虑：首先需要的是廉价的疫苗，至少加入疫苗的成本后，动物性食品的价格能被消费者所接受，而且用该疫苗免疫大量的牛，还必须能有效地防止病原菌在肠道定居，目前采用的方法之一是：利用无毒性的能在肠道大量定居的活菌疫苗，通过小剂量的疫苗接种，在牛肠道大量增殖从而成功地免疫动物，但这一方法的缺点是动物在养殖过程中饲喂抗生素或经胃肠道消化可能杀死或抑制菌苗的生长，使其不能大量繁殖，而且疫苗株在体内有可能获得噬菌体而变成毒性株，除非经过基因工程技术处理，能消除这种可能性；第二种比较经济而且常用的方法是通过饲喂可食疫苗对牛进行免疫，这一疫苗的完成需要在植物中表达紧密素或出血性大肠杆菌其他肠道定居因子，此方法非常有潜力而且经济，但还是有一个重要的缺陷，转基因植物表达紧密素或其他定居因子在小范围实验中可能是有免疫原性的，但这样的转基因食物重复间隔的长期食用将导致免疫耐受，若打破形成的免疫耐受，可能需要配合强有力的黏膜佐剂如LT和ST，如果这些分子在转基因植物中能共同表达，才有可能防止免疫耐受的发展，发挥较好的免疫作用。

（2）主动免疫防止感染人类的免疫策略

有一些间接证据表明，人接种菌苗对预防EHEC感染有效。研究表明，虽然免疫接种对细菌定居影响较小，但可预防疾病的发生和发展。在发展中国家EHEC病发病率低的一种可能的解释，在幼年经常接触肠致病性大肠杆菌（EPEC）可预防EHEC病，因为两者具有交叉反应性毒力决定簇，如外膜黏附素。鉴于O157∶H7的高发病率、严重性以及可以丧失生产力，抗生素治疗还可能加重病情，导致肾脏出血综合征，为此有效的免疫预防是控制其感染发病的主要手段，其中以有效的疫苗接种为免疫预防的重要内容之一。

肾脏综合征是O157∶H7最严重的疾病，在尚无有效治疗方法的情况下，针对目标人群实施免疫是控制该病发生的最实际选择。由于O157∶H7感染的机理包括两个方面：即在肠道定居和产生毒性很强的Stx，所以EHEC疫苗设计极为重要的抗原是Stx，一种理想的广谱EHEC疫苗应该能够抗Stx体液免疫和抗紧密素和其他定居因子的局部肠道免疫，各国研究人员在这方面进行了大量的研究，这些研究为EHEC及其他肠道致病菌疫苗的成功构建奠定基础。

根据EHEC感染和传播的特点，EHEC的疫苗研制主要包括两方面：动物用疫苗和人用疫苗。由于EHEC的主要宿主是牛和其他反刍动物，反刍动物和人接种疫苗需要用不同的方法，前者接种的目的是缩短动物体中该菌的定居时间和阻断对人的传播，而对目标人群进行免疫的目的则是预防原发感染和在阻止严重后遗症的发生，正在研制的疫苗有减毒活菌苗和全菌体死疫苗，多糖-蛋白结合疫苗和Stx类毒素亚单位疫苗。随着该菌功能性蛋白陆续发现，相应基因克隆完成，动物模型构建不断完善，EHEC疫苗研制不断取得新的进展。

5.3.4 小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）

5.3.4.1 食品卫生学意义

小肠结肠炎耶尔森氏菌是国际上引起重视的人畜共患病原菌之一，也是一种非常重要的食源性病原菌。耶氏菌共有4个亚属，小肠结肠炎耶尔森氏菌是其中一个亚属，其他还有鼠疫耶氏菌（Yersinia pestis）、假结核耶氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）和鱼红嘴疫耶氏菌（Yersinia ruckeri）。而小肠结肠炎耶尔森氏菌包括4个种，即典型小肠结肠炎耶尔森氏菌、弗氏耶氏菌（Y.frederiksenii）、中间型耶氏菌（Y.intermedia）、克氏耶氏菌（Y.kristensenii），前者是致病的，后三者均为非致病的。一般我们说小肠结肠炎耶氏菌即是指典型小肠结肠炎耶尔森氏菌。

本菌主要存在于人和动物的肠道中，据调查报告从人及猪、牛、羊、马、狗、猴、猫、骆驼等许多哺乳动物，鸡、鸭、鹅、鸽等多种禽类，鱼、虾等水生动物，蛙、蜗牛等冷血动物，昆虫均曾分离到本菌。食用动物带菌率较高，通过食品加工过程造成对食品的污染也较严重，据调查报告德国市场出售的鸡肉带菌率为28.9%、猪肉34.5%、牛肉10.8%，还有的国家报告猪肉检出率10.8%、鸡肉为34.5%、牛肉14.6%，我国有一些单位也从不同食品中、不同程度地检出本菌。

由于本菌分布广泛，食品污染率高，所以对人体健康造成严重威胁，除引起皮肤结节红斑、丹毒样皮疹、关节炎和假阑尾综合征等感染性疾病外，还经常引起暴发性的食物中毒。世界上越来越多的国家报道了发生小肠结肠炎耶尔森氏菌感染和中毒的事例。动物性食品常常被本菌污染，常见的有肉类、奶类食品。我国1987～2010年报道5起，在所有食物中毒事件比为0.33%（居第17位），主要涉及小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌。1987年3月沈阳市某中等专科学校食堂就餐545人，351人发生耶氏菌食物中毒，发病率64.4%，病原为O∶9型小肠结肠耶尔森氏菌。

本菌在外界环境中不仅具有长期保存生命力的特性，而且可以生长繁殖，是较为典型的嗜冷菌，在4℃下存活18个月，冷藏食品可防止其他病原菌的繁殖，而本菌在0～4℃仍能继续繁殖并产生毒素，在冰箱内存放的污染食品，对人仍具有感染性，对这种可通过食物传播而又具有嗜冷性的致病菌必须引起足够的重视。世界许多国家已将本菌列入食品检验法规，如1978年美国把本菌列入食物中毒原因菌，日本中央法规（1983年）中列入了本菌的检验。1985年我国卫生部颁布了食品中本菌的检验方法（国家标准），2008年最新版国家标准检验方法《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》颁布。

5.3.4.2 主要特征

（1）形态及染色特征

本菌为短小、卵圆形或杆状的革兰氏阴性杆菌，单在、短链或成堆排列，22～25℃幼龄培养物主要呈球形，大小为（0.99～3.45）μm×（0.52～1.27）μm，无芽胞，无荚膜。30℃以下培育有鞭毛，37℃则无鞭毛。25℃生长的培养物细菌具有1～8根周鞭毛，其鞭毛数根据生物型的不同而多少不一，生物1～3型的菌株有2～6根鞭毛，多者达18根鞭毛，生物4～5型的菌株多数只有1根鞭毛，动力不活泼，在陈旧培养物呈多形性，普通碱性染料易于着色，美兰染色可显示两极浓染（图5-3-13、图5-3-14）。

（2）生长要求与培养特性

本菌为需氧和兼性厌氧菌，生长温度范围为0～45℃，最适生长温度25～30℃。生长的pH范围4～10，最适生长pH7.2～7.4。对营养要求不高，在普通培养基上均能生长，但生长缓慢，对胆盐、煌绿、结晶紫、孔雀绿及氯化钠均有一定耐受性，所以常用的肠道选择培养基上均能生长。

① 普通琼脂 培养24～48h，菌落呈圆形，光滑，稍隆起，透明或半透明，大小为0.5～2mm。继代培养后，容易变异，形成R型。

② S.S琼脂 菌落呈圆形，光滑，稍突起，略呈浅橘红色，或淡粉色，大小比普通琼脂小，24h为0.1～0.3mm，48h可增大到0.4mm。

③ 麦康克琼脂 菌落呈圆形，光滑，透明或半透明，略扁平，淡粉色，大小比S.S琼脂稍大，48h为0.5～0.7mm。

④ 普通肉汤 呈均匀混浊，偶有薄膜或少量沉淀物。

（3）生化特性

本菌生化特性不稳定，培养在25℃和37℃反应结果有差异，能发酵葡萄糖、苷露醇、蔗糖、山梨醇。尿素酶阳性，鸟氨酸脱羧酶阳性，β-半乳糖苷酶阳性，MR试验阳性，V-P试验（22℃）阳性，V-P试验（37℃）阴性，不分解乳糖、鼠李糖。苯丙氨酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、H₂S阴性，不利用枸橼酸盐。

1984年“Bergey细菌分类手册”介绍的生物型分类见表5-3-12。

5.3.4.3 抵抗力

本菌对热敏感，60℃ 30min，65℃ 1min即可杀死，但据澳大利亚的两个乳品厂的巴氏消毒牛乳和奶油中分离出本菌，这说明牛乳中的耶氏菌通过巴氏灭菌不能完全被杀死。对低温有较强的耐受性，在4℃下可活存18个月，在-18～-20℃冷藏肉的保藏过程中，菌数明显减少，辐射对本菌有一定的杀灭作用。有人通过试验，用紫外线照射20min，不能全部杀灭耶氏菌，在碎牛肉中的耶氏菌经60krad照射后，约有25%存活菌。在0.5% KOH液中能存活10～15min，胆盐对耶氏菌的抑制作用与胆盐种类、浓度、血清型及培养基中的成分有关，3号胆盐加至5%浓度耶氏菌发育不受影响，但有的血清型在较低浓度的胆盐溶液中也很敏感。有耐盐性，据报道在牛心浸汁肉汤中培养，NaCl浓度可达5%仍能生长，到7%的NaCl才可以抑制耶氏菌生长。有少数菌株在10% NaCl中仍能生长。本菌对抗生素的敏感性不定，但对青霉素、红霉素、先锋霉素、氨苄青霉素是不敏感的。

5.3.4.4 致病性

小肠结肠炎耶尔森氏菌已经明确的毒力因子包括有V和W抗原、两种侵袭素（inv和ail）及肠毒素和LPS内毒素等，另外质粒编码的温度诱导性外膜蛋白Yops和染色体编码的高分子量铁诱导蛋白HWMP2也对其致病性有重要影响。

（1）中毒表现

潜伏期短者1～3d，一般3～5d，长者10d。中毒表现还是以消化道症状为主，腹痛、腹泻、发热、水样便为主，少数病人软便，体温38～39.5℃。其次是恶心、呕吐、头痛等表现。病程一般为2～5d，长者可达2周。儿童发病率比成人高，通常为50%。

中毒表现多种多样，且随着年龄不同而不同，2岁以下腹痛、发热、胃肠炎为主；儿童和青少年以类似急性阑尾炎的表现，成人可出现结节性红斑、关节炎等常见；如出现败血症，可致死亡，病死率可高达34%～50%。

（2）基因组

目前三种主要致病性耶氏菌中，鼠疫耶氏菌三个菌株KIM、CO92、91001完成了全基因组序列测定，小肠结肠炎耶尔森氏菌仅8081菌株完成全基因组序列测定。染色体全长4615899bp，G+C含量为47.27%，携带一个质粒pYVe808167，721bp，G+C含量为43.92%。

（3）致病岛

致病性耶氏菌可分为低致病菌株和高致病菌株，低致病菌株感染后导致人类温和的肠道感染，低剂量对小鼠无致病性；高致病菌株可引起人类系统感染，低剂量可引起小鼠致死，这种毒力水平的差别取决于一个大的染色体片段的存在与否，这个与高致病基因型表达相关的区域被称作高致病岛HPI。HPI存在于鼠疫耶氏菌、假结核耶氏菌和小肠结肠炎耶氏菌中，在低毒性血清型耶氏菌中不存在。

① 耶氏菌高致病岛HPI的特性 通常HPI是不稳定的致病岛，其丢失的频率鼠疫耶氏菌为2×10³，假结核耶氏菌为1×10⁴，但小肠结肠炎耶尔森氏菌中HPI较为稳定。在不稳定的HPI中有几个重复序列DRs及多拷贝的IS100插入元件（鼠疫耶氏菌和假结核耶氏菌），IS1400（小肠结肠炎耶尔森氏菌）和一个功能性的整合酶，而小肠结肠炎耶尔森氏菌则缺乏整合酶基因和重复序列DRs，这些差别解释了HPI在三个菌属中的相对稳定性。

HPI由一个保守的核心区域以及无确定功能的部分组成，保守的核心部分包括Ybt生物合成，调控和摄取的基因，是一个对HPI的整合或剪切具有重要意义的区域，致病性耶氏菌的突出特征之一是通过Ybt的铁载体从宿主摄取铁，这也被认为是HPI的主要功能。在小肠结肠炎耶氏菌的HPI部分，已鉴定出24个编码序列，其中irp1-irp9、ybtA和fyuA组成HPI的核心，与Ybt的生物合成、传输调控有关，类似P₄噬菌体整合酶基因的intB基因也位于该核心上，但是此基因发生了突变，这可能是小肠结肠耶氏菌HPI的不能精确切除的原因之一。

② HPI的结构特点 a.它是一个大的染色体DNA片段，三个致病菌属HPI大小为36～43kb。b.铁离子调节系统由HPI编码，该系统对高毒性血清型耶氏菌的表达非常重要。在细菌定居于真核细胞宿主过程中，铁离子是对细菌增殖影响较大的因子，HPI编码的该系统对耶氏菌胞外生活周期尤其重要。c.拥有四个插入序列ISI328、ISI329、ISI400和ISI122。d.HPI靠近一个tRNA基因一侧，它的一端为asn-tRNA基因而不是ISI100插入序列，在这一点，类似于大肠杆菌的致病岛PAI。e.HPI G+C含量与染色体基因不同，HPI G+C含量为60%，高于核心基因组G+C平均含量46%～50%，左侧32bp部分高度保守，而右侧部分很少是保守的，还有几个移动基因如插入序列或噬菌体基因。

有很多报道证实HPI在耶氏菌致病中的重要作用，通过对大量耶氏菌的调查表明HPI特异性基因的存在与这些自然分离株的致病性相关联。将分离的小肠结肠炎耶尔森氏菌IB，通过Tn5转座子使致病岛突变，该突变株则失去产生耶氏菌细菌素的能力。通对多种含有高致病岛的耶氏菌的研究最终证实irp 2和fyuA/psn基因对高致病岛的表型表达非常重要。其他耶氏菌细菌素操纵子基因目前还没有通过基因突变方法评价其毒性作用。

5.3.4.5 抗原构造

本菌具有耐热的菌体（O）抗原，不耐热的鞭毛（H）抗原和被膜（K）抗原，O抗原有84个因子，用阿拉伯数字1、2、3、4……表示，H抗原有20个因子，用小写英文字母a、b、c、d……表示，K抗原只有1个因子。根据O抗原，结合H抗原和K抗原，将本菌分成50余个血清型，目前我国采用49种O因子血清分群，其组成见表5-3-13。

多数菌株只含1个O抗原因子，部分菌株含有2个以上的O抗原因子。Ahnman发现小肠结肠炎耶尔森氏菌的O₉型与牛布鲁氏菌有交叉反应，还与革兰氏阴性肠道杆菌的脂多糖O抗原具有共同抗原，能与沙门氏菌O∶30、O∶12、O∶47、大肠杆菌、变形杆菌、志贺氏菌及霍乱弧菌稻草叶型等发生交叉反应，与野兔热杆菌也呈弱交叉反应，在进行血清学鉴定时，要注意鉴别。

小肠结肠炎耶尔森氏菌的血清型随地区、人群和动物种类不同而有差别，如美国和加拿大最常见者为O∶8型，在非洲和日本主要是O∶3型，其次是O∶5、O∶9型。我国发现的菌型为O∶3、O∶7、O∶8、O∶10、O∶16、O∶9、O∶21。已知感染人的主要血清型是O∶3、O∶5、O∶8、O∶9。

VW抗原：已知该菌的某些菌株具有与鼠疫耶氏菌和假结核耶氏菌在免疫学上相同的VW抗原。在37℃生长时需要钙，而在25℃生长时不需要钙的菌株即含VW抗原。Karmali等人将从病人粪便检出的O∶21血清型自凝阳性的菌株，在草酸镁琼脂上于35℃培养不生长，用于口服小鼠则产生腹泻。可见自凝阳性与缺钙培养基上35℃无生长能力是一致的，能使小鼠发生腹泻。

5.3.4.6 毒素

小肠结肠炎耶尔森氏菌的部分菌株能产生一种耐热性肠毒素，分子量在10000～50000Da，该毒素在121℃30min不被破坏，4℃放置7个月不失其活性。pH 1～11的环境中不被破坏，肠毒素只在室温（25℃）下培养能迅速产生，37℃则不产生。肠毒素可在食品中形成，在食品加工和储存中存留，并不受胃酸环境的影响，被人食用后，即可发生中毒。

此外，毒力抗原（又称VW抗原）是耶氏菌重要的毒力因子，它是一种蛋白-脂蛋白复合物。有致病性的小肠结肠炎耶尔森氏菌均能产生VW抗原，VW⁺阳性菌株不论是皮下接种或饮食均能感染小鼠，使其发生腹泻和死亡。而VW阴性菌株则不能。

5.3.4.7 细菌学检测

（1）小肠结肠炎耶尔森氏菌的国家常规检验方法

国家标准检验方法《食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》（GB/T 4789.8—2008）适用于食品中小肠结肠耶氏菌的检验（图5-3-15）。

（2）其他检验方法

在食品或环境中由于致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌存在数量较少，直接在选择性培养基上培养往往难以直接分离到，为了增加小肠结肠炎耶尔森氏菌在这些样品中的数量，可先在液体培养基中先进行富集。有几种方法可以利用：①冷富集 小肠结肠炎耶尔森氏菌不同于其他肠道菌，有耐冷的自然属性，为此可以在4℃不同的培养基中延长培养期进行增菌2～4周，PSB和PBS是广泛用于食品或环境样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌冷富集的培养基。为了限制其他非致病菌的生长可加入KOH。②选择培养 在普通培养温度中进行小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离培养，可通过选择性培养基，如：Wauters等制备的MRB或TTC可以将样品在25℃培养2～4d，用于血清型4/O：3增菌。Schiemann 等用BOS增菌分离血清型IB/O∶8，Landgraf等用TSB和TSPN在18℃培养3d分离牛奶中的小肠结肠炎耶尔森氏菌。③选择性琼脂平板 选择性琼脂平板常用的有MAC（麦康克）、CIN、SSDC等。其中CIN琼脂是分离样品尤其是粪便样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌选择性最强的培养基（但血清型3/O∶3在CIN中则生长被抑制）。④鉴定 在CIN琼脂上的单个菌落进行生化鉴定。商业上快速鉴定系统API20E系统已广泛使用，该系统可以将28℃培养的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行鉴定，符合率达93%。⑤致病性检测 由于分离的小肠结肠炎耶尔森氏菌需要进行致病性与非致病性鉴定，表型鉴定不仅费时而且不完全可靠，为此以DNA为基础的方法进行小肠结肠炎耶尔森氏菌鉴定的研究较多，菌落杂交方法使用的基因探针主要是根据该菌的毒性质粒和染色体上已知毒性功能的特异性DNA片段而设计的，PCR技术在检测微生物纯培养物时非常有效，但在一些样品如食品、血液、粪便中PCR方法检测的敏感性则受到抑制。有几种前处理方法包括富集、稀释、过滤、离心、吸收等，可针对不同的样品使用，然后进行DNA提取和样品的PCR检测，可获得较好的检测结果。有一些研究利用PCR方法检测质粒Pyv中特异性基因，但质粒在传代培养和贮存时可能发生丢失，为此利用PCR技术检测染色体上毒力基因的检测方法更为常用。其中ail基因（编码侵袭素）是最常检测的目的基因，还有一些方法检测inv基因（编码侵袭素）和yst基因（编码耐热肠毒素），小肠结肠炎耶尔森氏菌16S rRNA基因用于血液样品的检测效果较好。Alissa D.Jourdan等通过荧光PCR检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌，检测细菌染色体编码的黏附与侵袭基因ail，这种方法能够检测猪肉和粪便样品在选择培养基24h富集培养物，检出率为≤1CFU/g。越来越多的方法发展多重PCR进行毒力基因检测，如virF和ail基因共同检测，Lantz等用多重PCR方法同时检测质粒中的yadA基因和耶氏菌特异区16S rRNA，Harnett等用多重PCR方法检测yst、ail和virF基因（virF基因调控外膜蛋白结构基因的表达）。此外，小肠结肠炎耶尔森氏菌感染的快速诊断可通过选择性培养基初筛后，再用抗该菌外膜蛋白单克隆抗体检测或利用提纯的外膜蛋白进行抗体检测。

（3）RAPD核糖体分型

PFGE等分子生物学方法用于流行病学分析已经广泛使用。其中PFGE方法是最理想的，即每一株与流行的无关菌株都有独特的酶切图谱，而流行株的酶切图谱是共同的。如对血清型O∶3/4的区分可用PFGE方法用XbaⅠ和NotⅠ酶切。

（4）血清学分型

根据本菌的O抗原可将其进行血清型分群。目前国内采用49种O因子血清进行玻片凝集试验，同时以盐水作对照排除自凝菌。引起食源性疾病常见的是O∶3、O∶5、O∶6、O∶7、O∶8、O∶9、O∶21和O∶22等。吖啶橙免疫荧光菌团法可进行初筛，荧光显微镜低倍镜下观察，见有疏松网团状或细砂粒样集合体，形状不规则，呈鲜苹果绿色的荧光，而周围较暗者为阳性结果。把阳性培养物移种琼脂平板上继续分离培养，鉴定。

总之，关于小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法的研究比较多，但至今没有理想的分离方法是该菌检测敏感性低的原因之一。在早期的一些研究中致病性耶氏菌检出限制是每克粪便或猪肉样品10³～10⁶CFU/g，由于致病性耶氏菌与非致病性耶尔森氏菌有类似的表型，而选择性富集培养基能区分其致病性，血清型4/O∶3常被检出的原因可能是分离方法更适合该血清型，PCR方法提供了一种更利于区分小肠结肠炎耶尔森氏菌致病性的方法，RT-PCR是鉴定和计算自然样品中致病性耶氏菌的快速敏感的方法，未来可以考虑利用RT-PCR方法进行该菌的检测来加强整个检测过程的自动性，使其成为食品工业、实验室诊断和流行病学研究中成熟的应用方法。

5.3.4.8 食品生产综合控制

小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、蛤和虾，也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植物。已从家畜、狗、猫、山羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥可能是带菌者，猪的带菌率较高，日本报告检出率为4%，加拿大为3.6%，丹麦为10%～17%。该菌最易在猪扁桃腺中发现，由于大多数待宰猪只扁桃体都携带此菌，因此在屠宰场中控制此菌的传播比较困难，猪健康携带者的大量存在及广泛传播使该问题更加恶化。猪的屠宰加工质量明显影响着小肠结肠炎耶尔森氏菌的传播，因而改进屠宰加工技术可阻止该菌的传播，其中最重要的是加强对猪头和下水的处理。此外，对该菌的快速检测方法进行研究用于食品生产的综合控制和流行病学研究对防止污染有特别重要的意义。

5.3.5 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus） 

5.3.5.1 食品卫生学意义

副溶血性弧菌属于弧菌属的一种嗜盐杆菌（嗜盐弧菌），主要存在于海水和海产品中的海洋性细菌。引起中毒的食物主要是海产品，如梭子鱼、乌贼、海鱼、小海产品如蛤蜊、牡蛎、黄泥螺、海蜇等，在鱼体的带菌率低者达20%、高者达90%；其次是蛋品、肉类或蔬菜。其中以各种海产品带菌情况普遍，墨鱼最高，带菌率93%，梭子鱼78%，带鱼41.2%，黄鱼27.3%；淡水鱼中也有本菌的存在。在咸菜、肉类、禽类和蔬菜等产品中也普遍存在，腌制品污染的数量约占半数。当致病性菌株污染产品被人不慎食用后，可引起胃肠炎，该菌也是沿海地区食物中毒暴发的主要病原菌之一。最早在日本引起发病的食物主要是海产品，其后在我国沿海地带及岛屿地带均有发现，是沿海地区食物中毒之首。

副溶血性弧菌中毒一般是暴发性，较少是散发现象。大多发生于6～10月份气候炎热的季节，寒冷季节则极少见。潜伏期最短仅1h，一般在3～20h，食物中毒临床上表现为：上腹部疼痛、腹泻、恶心、呕吐等，腹泻多为水样便，亦有大便脓血。随后腹部剧烈疼痛，持续1～2d。主要病变在十二指肠，空肠和回肠上部。如痢疾者，一般病后3～5d痊愈，但重症者亦可造成脱水、休克。发生无年龄、种族的差异，而主要与地域和饮食习惯有很大关系。本菌引起的食物中毒主要是生食海产品，烹调加热不足或交叉污染引起。再一方面，如果食用同样污染的食物，经常接触该菌的人较不易发病。

5.3.5.2 主要特征

（1）形态与染色特征

本菌为革兰氏阴性弯曲的球杆菌，或呈弧菌，两端有浓染现象，其中间着色较淡或不着色。一端有鞭毛，运动活泼，菌周也有菌毛。大小为0.7～1.0μm，有时有丝状菌体，可长达15μm。本菌在不同的生长环境中出现的菌体形态也有些差异，呈现多形性。主要出现的形态有球状、球杆状、卵圆形和丝状。本菌的排列不规则，多数散在，有时成对存在，见图5-3-16。

在S.S琼脂和血平板上培养，细菌大多数呈卵圆形，少数呈杆状或丝状，两端浓染，中间着色淡甚至不着色。在嗜盐琼脂上，本菌主要为两头小而中间稍胖的球杆菌，在罗氏双糖培养基上，24h菌体基本一致，48h的培养物菌体形态的变化很大，有球状、丝状、杆状；弧状或逗点状等，其大小及染色特征差异也很大。

（2）生长要求和培养特性

本菌为需氧菌，需氧性很强，对营养的要求不高，但在无盐的环境中不能生长。在食盐0.5%的培养基中即能生长，所以在普通琼脂上或蛋白胨水中都能生长，而本菌在含盐3%～3.5%的培养基上生长最好。易形成扩散性菌落，是本菌典型特征之一（图5-3-16）。其生长适宜的pH7.0～9.5，而最适pH7.4～8.0，适应温度范围15～48℃，生长发育最适宜的温度为30～37℃，在液体培养基中呈现混浊，表面形成菌膜，R型菌发生沉淀。在固体培养基上的菌落通常为隆起、圆形、稍混浊不透明，表面光滑湿润，传代之后常出现不圆整、粗糙型菌落，或灰白色半透明或不透明的菌落。从腹泻病人中分离的菌落多较典型，从食品中分离的细菌多为R型，在血琼脂平板上菌落的周围可见溶血环。

在S.S平板上菌落中等大小，1～2mm圆形，扁平，无色透明的黏性菌落，不易被接种环挑起。在氯化钠蔗糖琼脂上，菌落1～2mm，稍隆起，混浊、无黏性、绿色、湿润、中心绿色的菌落，具有扩散性菌落是本菌的一个生长特点，主要是因为细菌生长得太快（图5-3-17）。本菌在伊红美兰琼脂上不生长，某些菌株在麦康凯上生长，生长的菌株菌落呈圆形、平坦、半透明或混浊，略带红色。在3.5%食盐琼脂平板上，37℃ 24h培养多呈蔓延状生长，菌落的边缘不整齐、圆形、隆起，稍混浊、不透明、表面光滑湿润。如培养基中含有胆酸盐则能对细菌的蔓延有一定的抑制作用。细菌在生长过程中形成色素。

（3）生化特性

副溶血性弧菌能分解发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉和阿拉伯胶糖产酸不产气。不能发酵乳糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、卫矛醇、肌醇、水杨苷。产生靛基质，液化明胶，硝酸盐还原为亚硝酸盐。过氧化氢酶和卵磷脂酶为阳性，尿素酶阴性，V-P试验阴性，不产生硫化氢。能分解淀粉和酪蛋白。甲基红试验阳性。对弧菌抑制剂三氨基二异丙基喋啶敏感（表5-3-14）。

副溶血性弧菌溶血试验有些特殊，从患者样品中分离的菌株在含有人血和家兔红细胞的培养基中生长，能产生β溶血，而从海水中及海产品中分离的菌株则不溶血，一般称此现象为神奈川（Kanagawa）现象。而能在神奈川培养基上产生β型溶血者，称为神奈川试验阳性。而从患者样品分离出的细菌神奈川阳性率为96.5%，阴性只有3.5%。相反，从海水及海产品中分离的菌株，阴性占99%，阳性只占1%。在对志愿者口服时，神奈川现象阳性菌2×10⁵～3×10⁷个菌就能引胃肠炎，而阴性者食入1～2×10⁶个菌也不能引起发病。副溶血弧菌的此种溶血性与肠道致病性有关。

本菌与海水中溶藻性弧菌的生化特性十分相似，但通过V-P反应、蔗糖发酵及在10%NaCl蛋白胨水中生长的情况加以区别，前者均阴性反应，后者则呈阳性反应。与溶藻性弧菌和其他类似弧菌进行鉴别（表5-3-15、表5-3-16）。

对青霉素和磺胺嘧啶等药物有耐药性，对四环素、氯霉素、合霉素、头孢曲松、环丙沙星、庆大霉素、米若环素、萘啶酸、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、替卡西彬棒酸、妥布霉素、复方新诺明等抗生素完全敏感。对β-内酰胺族（如青霉素及头孢等）部分或完全耐药，对头孢呋辛新酯、头孢呋辛、头孢噻吩和头孢唑啉有极高的耐药率，均在50%以上；对胺苄西林、羧卡西林、阿莫西彬克拉维酸的耐药性分别为49.17%、43.33%、32.50%。

5.3.5.3 抵抗力

副溶血性弧菌在自然界不同的水中生存时间很不一致，在淡水中1d左右即死亡，在海水中则能存活47d以上。在pH6.0以下即不能生长，但在含盐6%的酱菜中，虽pH降至5.0，仍能存活30d以上。本菌对热敏感，65℃5～10min，90℃3min即可将其杀死。15℃以下生长即受抑制，但在-20℃保持于蛋白胨水中，经11周仍能继续存活。该菌对酸的抵抗力较弱，2%醋酸和食醋中1min即死亡。对氯、石碳酸、来苏儿抵抗力较弱，如在0.5mg/L氯中，1min死亡。

5.3.5.4 致病性

（1）中毒表现

由本菌引起食物中毒的潜伏期2～26h不等，最短者仅为1h，一般为6～10h，主要症状为腹痛、腹泻、呕吐、发热等，本病多发生在夏秋季，病程1～7d不等，一般恢复较快。病后带菌时间短，不超过一周，健康人带菌率为1%左右，但海产作业有关人员带菌率稍高。

（2）抗原特性

本菌有3种抗原成分：一种为H抗原，又称不耐热抗原，经加热100℃30min即被破坏；另一种是O抗原，又称耐热性抗原，加热100℃仍有活力，保持其抗原性；另一种为K抗原存在于活菌的表面，可阻止抗菌体血清与O抗原发生凝集，但K抗原亦不耐热，并在菌种保存过程中往往发生变异。目前已知O抗原被分成12个群。K抗原则有近70种。通过对副溶血性弧菌进行免疫及抗原分析，利用吸收试验将O抗原分成28个因子，1因子是共同因子，2～27因子经过吸收试验可做单因子血清，2～16因子只占总数的2.1%，2～16因子血清能与绝大部分不同来源的菌株发生凝集。

（3）副溶血性弧菌的基因组

副溶血性弧菌的基因组也是由大小2条环状染色体组成，大小分别为2.9Mb和1.88Mb，两者的G+C含量均为45.4%。rRNA操纵子有11个，10个位于大染色体，1个位于小染色体。据鉴定，共有4832条编码序列，大小染色体上各有3080条和1752条，其中约有40%根据其他细菌的基因序列注释了可能的编码蛋白。大部分细菌存活生长需要的基因位于大染色体，但小染色体中也有数个与关键代谢有关的基因。小染色体比大染色体含有更多的转录调节基因和底物转运基因，提示小染色体在适应环境变化中起着一定的作用。

超级整合子岛（一种基因捕获系统）在副溶血性弧菌中位于大染色体上。除了共有2个relB基因外，此两种超级整合子中所含的其他基因几乎完全不同。

编码副溶血性弧菌耐热直接溶血素（thermo-stable dithemolysin）的基因组被发现位于小染色体上一个80kb的毒力岛内。此毒力岛中还发现有数个与细菌毒力有关的基因及一组Ⅲ型分泌系统基因。

（4）致病菌株

本菌食物中毒的发病机理目前尚不十分清楚，家兔的肠结扎试验是阳性反应，受结扎的肠管膨隆表面呈红色或暗红色，肠管内有大量的渗出物积滞，肠壁出血变薄，皱襞消失。与菌株毒力有关的因素有：①耐热性溶血素；②不耐热性溶血素；③磷脂酶；④溶血磷脂酶；⑤霍乱原样毒素；⑥胃肠毒素等。组织切片显微镜检查证明细菌可穿过回肠上皮侵入固有层，在死亡病人的尸体解剖时可看到肠上皮炎症反应。发现肠管有轻度糜烂，胃黏膜发炎，各脏器瘀血等，完全出现肠毒素样病变。因此，有报道证实，其中毒与该菌产生的溶血素有关。耐热性溶血素可使小鼠、豚鼠的回肠段、心肌细胞发生变性，是一种心脏毒素。

5.3.5.5 细菌学检验

副溶血性弧菌的检验按GB 4789.7—2013进行，见图5-3-18。

（1）样品的采集

鱼类最好是表面组织、肠或腮；贝类动物的全部内容物；甲壳类尽可能取全动物或动物的内脏部分，包括肠和腮。捣碎后称50g作为检验用样品。

（2）增菌培养和分离培养

首先将样品接种于氯化钠蔗糖琼脂（或嗜盐菌选择性培养基）和S.S琼脂平板各一块；同时接种氯化钠结晶紫增菌液，37℃培养8～16h以后，再接种上述平板分离。分离平板培养18～24h取出观察。亦可接种于TCBS上分离培养。在氯化钠蔗糖琼脂平板上菌落呈绿色，较大，无黏性，呈扩散性菌落。S.S琼脂平板上菌落中等大，有黏性不易挑起。

（3）三糖铁试验

挑取可疑菌落转种3.5%氯化钠三糖铁琼脂斜面上，37℃培养18～24h观察结果。培养基底层变黄（葡萄糖分解产酸不产气），上层斜面不变色（乳糖不分解）。有动力，不产生硫化氢者，进行镜检。

（4）涂片染色镜检

将三糖铁琼脂斜面上可疑菌落涂片，革兰氏染色镜检。应为革兰氏阴性，多形态，无芽胞杆菌。如符合上述特性，要进一步做嗜盐性试验和其他生化反应。

（5）嗜盐性试验

嗜盐性试验：将上述可疑培养物接种于无盐胨水、7%及11%氯化钠胨水，37℃培养24h后观察生长情况。在无盐及11%氯化钠胨水中不生长，7%氯化钠胨水中生长良好者，继续进行鉴定。副溶血性弧菌在不同培养基中生长的菌落特征见表5-3-17。

（6）动物试验

凡符合副溶血性弧菌生化反应的菌株，一般均有毒力。如需做动物试验，将菌株接种在3.5%氯化钠胨水中培养16～18h，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2～3d，死亡小鼠剖检和分离培养。如需测定毒力，不同剂量如0.3mL、0.1mL、0.03mL、0.01mL接种小鼠腹腔，每个剂量接种3只小鼠，观察发病及死亡情况。

接种后的小鼠，一般于次日出现竖毛，运动不活泼，食欲不振，呼吸困难，步行蹒跚，有时发生痉挛性跳动，四肢抽搐和尾部痉挛颤动，多数于24～48h死亡。

5.3.5.6 食品生产中的综合控制

注意控制菌体繁殖的条件和杀灭病原菌。对水产品烹调要格外注意，应煮透煮熟，切勿生吃。加强生鲜海产食品的卫生监督和检验，梭子鱼、蟛蜞、海蜇等水产品宜用饱和盐不浸渍保藏（并可加醋调味杀菌），食前用冷开水反复冲洗。由于副溶血性弧菌对酸的抵抗力较弱，可食醋拌渍。动物性食品、肉块要小，应该充分煮透煮熟，防止里生外熟。器具要分开，注意消毒，防交叉污染。因该菌对温度抵抗力弱，故海产品或熟食品应低温冷藏。

5.3.6 空肠弯曲菌

5.3.6.1 食品卫生学意义

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）为弯曲菌属中的一个种，是引起散发性细菌性肠炎最常见的菌种之一。该菌常通过污染饮食、牛奶、水源等被食入，或与动物直接接触被感染。由于空肠弯曲菌对胃酸敏感，经口食入至少10⁴个以上细菌才有可能致病，该菌在小肠内繁殖，侵入肠上皮引起炎症。

空肠弯曲菌广泛存在于家禽、鸟类、狗、猫、牛、羊等动物体中，猪盲肠带菌率59.9%、牛盲肠26.5%、鸡60%～90%。苏州调查显示鸡带菌率为89.3%、狗75%、猪61.5%、鸭79.2%。在肉品的污染也是严重的，英国检查的6169个牛和猪的肉样，总阳性率为1.6%，屠宰场肉样为4%。日本调查猪肘子的本菌检出率为10%，肝脏16.6%。吉林省某地肉联厂屠宰猪胴体表面阳性检出率为56.1%；江苏的半净膛鸡阳性率为10%。临床表现为痉挛性腹痛、腹泻、血便或果酱样便，量多；头痛、不适、发热。通常该病自限，病程5～8d。

本菌对人体健康的危害是比较严重的，在英国、日本、美国及其他一些国家均有本菌引起的食物中毒报道，如英国（1981）因饮用污染本菌的生乳，暴发病例达2500人。日本发生一次性污染水源引起的7751人发病。近期我国的调查情况说明该菌是我国主要食物中毒菌之一。

5.3.6.2 主要特征

（1）形态及染色特征

本菌在感染组织中呈弧形，撇形或S形，经常见两菌连接为海鸥展翅状，偶尔为较长的螺旋状。在培养物中，幼龄时较短，大小约（0.2～0.5）μm×（1.5～2.0）μm；老龄者较长，一般可达8μm，有的长度可超过整个视野。另外，在老龄培养物中也可见到球状体。不形成芽胞或荚膜，但某些菌株特别是直接采自动物体病料内的细菌，具有荚膜。撇形者为一端单鞭毛，S形者可为两端鞭毛，运动甚为活泼，在暗视野相差显微镜下观察，呈螺旋形滚动，如投掷标枪式迅速前进。DNA中的G+C含量为31%。

染色时，用沙黄不易着色，5倍稀释的石炭酸复红效果较佳。革兰氏染色阴性（图5-3-19）。

（2）生长要求及培养特性

本菌系微需氧菌，在大气和绝对无氧环境中不能生长，以在5%氧气、85%氮气与10%二氧化碳环境中生长最为适宜。生长温度范围37.0～43.0℃，但以42～43℃生长最好，25℃不生长，在其最适温度中培养既有利于本菌生长发育，又可抑制肠道部分杂菌的生长。新鲜组织或胃内容物等培养基生长良好。

常用的液体培养基有硫乙醇酸钠肉汤和布氏肉汤等，固体培养基有Skirrow培养基、Butzler培养基、mCCD（改良弯曲杆菌基础培养基）硫乙醇酸钠琼脂等。

在固体培养基上，经过48h孵育后，出现两种菌落：一种为透明或半透明、扁平、光滑、湿润、有光泽、边缘不整齐的菌落，在湿润的培养基上多见；另一种为灰白色、圆形、边缘整齐、光滑、隆起、有光泽、水滴状菌落（图5-3-19）。

在一般肠道培养基上不生长，在麦康凯琼脂上不生长。在液体培养基是混浊生长，但底层可见沉淀。

5.3.6.3 生化特性

本菌生化反应不活泼，不发酵糖类，在呼吸代谢中无酸性或中性产物，从氨基酸或三羧酸循环中获得能量。MR试验、V-P试验、靛基质试验均阴性，不分解尿素、不液化明胶，无酯酶活性，不产生色素，氧化酶和接触酶阳性。

5.3.6.4 抵抗力

抵抗力较弱。培养物放置冰箱中很快死亡，56℃5min即被杀死，干燥、日光亦可迅速致死，培养物放室温可存活2～24周，但冷冻干燥可保存其生活力达13～16个月。

对常用的药物，大都比较敏感，对部分药物有耐药性。一般对庆大霉素、四环素族、氯霉素族、卡那霉素、链霉素等敏感；而对青霉素类、万古霉素、杆菌肽、多粘菌素及磺胺药等有耐药性。

5.3.6.5 致病性

（1）中毒表现

潜伏期短者1d，长者10d，一般3～5d。突然发生腹泻和腹痛，腹痛可呈绞痛，腹泻一般为水样便或黏液便，重病人有血便，每日腹泻数次至10余次，带有腐臭味。发热，38～40℃，特别是当有菌血症时出现高热，也有仅腹泻而不发热者。还有头痛、倦怠、呕吐等，偶有重者死亡。病程一般1周左右。

空肠弯曲菌是一种重要的人畜共患病的病原菌，它可引起羊流产、猪、狗、猫、猴等动物的肠炎，牛乳房炎，禽类肝炎以及人类的腹泻和败血症等。本菌还可以作为致病菌和正常菌群的成员存在于动物的肠道中，尤其是鸡和猪的带菌率很高，可以达到80%～100%。随粪便排出体外，污染环境、水源。多种动物性食品及水源被污染，可以引起人类空肠弯曲菌肠炎的流行。

（2）毒素

本菌的致病因素主要是侵袭力、耐热性肠毒素（ST）及内毒素。经口感染本病后，通过胃防御屏障到达小肠，细菌借助于表面物质黏附定居于肠上皮细胞，起初位于肠绒毛隐窝处，此处为微需氧环境，适于本菌繁殖，所以在病初粪便中菌量少，粪便检查往往为阴性。由于细菌本身及毒素的作用，刺激肠壁蠕动加快，肠内容物流动快，致使肠道微环境的厌氧情况改善，为空肠弯曲菌的繁殖提供了有利条件，此时，粪便中菌量大大增加。另外本菌还可以产生致HeLa细胞和CHO（中国苍鼠卵巢）细胞致死的毒素（Cytolethal distending toxin，CDT），分子量1.2～1.4kDa。

5.3.6.6 细菌学检查

GB/T 4789.9—2008国家标准检验方法见图5-3-20。

可以用棉拭子直接挑取新鲜粪便或用肛拭子采集标本，食物样品直接无菌采取，立即送入实验室分离培养，或在4℃中不超过24h送检。若不能及时送往实验室，可将标本插入半固体保存培养基内，置于4℃冰箱中于3d内送往实验室，标本应在服用抗菌药物之前采取。

（1）细菌学检查

① 涂片镜检 取送检的标本直接涂片，用革兰氏染色或5倍稀释的石炭酸复红染色，发现本菌的典型形态（海鸥展翅状），可初步定为本菌。也可以暗视野显微镜直接检查，观测其动力。

② 分离培养 将被检标本直接或增菌后，接种于选择培养基上，置于微氧环境中培养48～72h，取出观察。发现相似菌落，可作石炭酸复红染色。氧化酶及过氧化酶试验，本菌均为阳性，对符合者，再做1%甘氨酸、3.5%氯化钠、硫化氢产生、25℃与42℃生长试验，即可根据本菌的特点做鉴定。

（2）血清学检查

① 血清学分型 目前国际上主要有两种分型方法：一是间接血凝试验，系以耐热抗原为基础，将细菌悬液先经100℃加热1h，提取可溶性耐热抗原，然后致敏绵羊红细胞，以此作间接血凝试验，至少可将本菌分为64个血清型；二是玻片凝集反应，系以不耐热抗原为基础，先用福尔马林抗原免疫动物制成抗血清；再先后用同型耐热抗原进行吸收与异型菌不耐热抗原进行吸收，制成特异的不耐热抗原血清，然后取活菌作为玻片凝集反应，可将本菌分为60多个血清型。

② 抗原或抗体的检测 目前已应用的试验有：试管凝集反应、间接血凝试验、荧光菌团试验、免疫酶染色法、酶联免疫吸附测定法等。用于病原的检测，以免疫荧光试验、间接酶联免疫吸附测定法的效果为好。如间接酶联免疫吸附测定的敏感性可达32万个菌/mL，且具有较强的特异性，并可于28h内报道结果。

另外，目前已制备了抗空肠弯曲菌的单克隆抗体和抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体，均可用于本菌的检验。

5.3.6.7 食品生产的综合控制

注意饮水和食品卫生，尤其是禽类肉品含菌量较高，防止生熟交叉污染，加强人、畜、禽类的粪便管理。

（1）控制传染源

空肠弯曲菌病最重要的传染源是动物，因此要把对畜产品中空肠弯曲菌污染控制的焦点放在其首要环节——养殖场。通过建立良好的畜禽生活环境，对养殖场的环境卫生、畜体卫生、饮水和饲料卫生等所有环节进行严格控制，从源头上控制空肠弯曲菌的传播。

（2）切断传播途径

切断传播途径一是要加强对畜产品加工、流通环节的监管。要求生产加工企业严格遵循畜产品安全生产技术规程，降低生产加工过程中畜产品被空肠弯曲菌污染的危险。二是应严格执行有关畜产品安全的法律法规，以法律的手段来约束整个畜产品生产链所有参与者的行为，尽量避免食用由空肠弯曲菌污染的畜产品而引起食物中毒的发生。

（3）减少易感人群

努力劝导消费者养成良好卫生的饮食习惯和个人卫生习惯。

总之，在畜产品整条生产链中，对养殖、加工、销售、食用等各个关键环节加以系统管理，按照空肠弯曲菌流行病学特点，沿着畜产品消费、生产一直追溯到源头实行全面控制，只有这样，才能实现“健康畜禽——安全畜产品——健康人类”的最终目标。

5.3.7 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus） 

5.3.7.1 食品卫生学意义

蜡样芽胞杆菌为需氧芽胞属成员，在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。在美国炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大陆由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。蜡样芽胞杆菌在食品上，于20℃以上的环境中放置能迅速繁殖并产生肠毒素，同时，由于致病性蜡样芽胞杆菌不分解蛋白质，因此，食品在感官上无明显变化，无异味，很容易误食而发生中毒。

据报道在533件肉和肉制品上阳性率为13%；136件以肉为基础的调味料，阳性率为3%；1049件乳及乳制品，阳性率为23%；523件饼干，阳性率为12%。引起食物中毒的食品必须含有大量的细菌菌体，每克（g）或毫升（mL）食品中约需含10⁷个以上的蜡样芽胞杆菌才能引起食物中毒。我国1973～2013年中毒事件198起，占所有细菌食物中毒事件构成比12.95%（居第二位）。食物中毒分两种类型：①呕吐型：由耐热的肠毒素引起，于进餐1～6h发病，主要是恶心、呕吐，仅有少数有腹泻。类似于葡萄球菌的食物中毒，病程平均不超过10h。②腹泻型：由不耐热肠毒素引起，进食后发生胃肠炎症状，主要为腹痛、腹泻和里急后重，偶有呕吐和发热。此外，该菌有时也是外伤后眼部感染的常见病原菌，引起全眼球炎。在免疫功能低下或应用免疫抑制药的患者中还可引起心内膜炎、菌血症和脑膜炎等。

5.3.7.2 主要特征

（1）形态及染色特征

蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大肠杆菌，菌体正直或稍弯曲，大小为（1～1.3）μm×（3～5）μm，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似（图5-3-21）。菌体内有异染颗粒、球状类脂颗粒或空泡样构造，具周身鞭毛，能运动，不形成荚膜，芽胞成椭圆形，位于菌体中央，芽胞发芽形成菌体后，芽胞衣迅速崩解。DNA中的G+C（摩尔分数）为31.7%～40.1%。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力。

（2）生长要求及培养特性

蜡样芽胞杆菌生长温度为25～37℃，最佳温度30～32℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3～10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，故名，边缘常呈扩展状。偶有产生黄绿色色素，有的菌株产生淡红褐色弥散性色素，也有的菌株在含铁丰富的淀粉培养基上产生红色色素，在MYP（甘露醇一卵黄多粘菌素琼脂）平板上菌落通常是伊红粉色，随着培养时间的延长则更明显（图5-3-21）。在血液琼脂生长迅速，呈草绿色溶血。于马铃薯斜面上呈奶油状生长，有时产生淡粉红色色素。在普通肉汤中呈均等大混浊状生长，并有容易散开的沉淀物，有的形成菌膜。

（3）生化特性

分解葡萄糖、麦芽糖、淀粉、蔗糖、蕈糖、水杨苷产酸，不分解乳糖，甘露醇、伯胶糖、鼠李糖、木糖、肌醇、山梨醇、側金盏花醇、木胶糖，靛基质试验阳性，硫化氢试验为阴性，尿素酶阴性，V-P试验阳性，KCN试验阳性，枸橼酸盐及卵磷脂酶阳性。还原美蓝，紫乳迅速胨化。能在24h液化明胶（表5-3-18）。

5.3.7.3 抵抗力

蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18%的条件下仍能存活或生长。蜡样芽胞杆菌耐热，其37℃16h的肉汤培养物的D值（80℃）（在80℃时使细菌数减少90%所需的时间）约为10～15min；使肉汤中细菌（2.4×10⁷/mL）全部杀死需100℃ 20min。其游离芽胞能耐受100℃30min，而干热灭菌需120℃ 60min才能杀死。

5.3.7.4 致病性

蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生肠毒素。已知有三种毒素，即溶血（haemolysin）致死性肠毒素BL（Hbl）、非溶血性肠毒素（non-haemolytic enterotoxin）（Nhe）和细胞毒性肠毒素（cytotoxin CytK）。引起腹泻型综合征的是一种大分子量蛋白，此毒素不耐热，能在各种食物中形成；而引起呕吐型综合征的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽，叫做cereulide（cyclic dodecadepsipeptide），由核糖体肽酶合成，由ces基因编码，100℃30min不能破坏，常在米饭中存在。cereulide主要阻止人的自然杀伤细胞，因此具有免疫调节作用。致呕吐（emetic）型综合征的肠毒素和致腹泻型综合征的肠毒素已提纯，基因已克隆。其纯化的肠毒素分子量为55～6.0×10³u。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。潜伏期短，一般为2～3h，最短为30min，最长为5～6h。中毒症状：呕吐100%，腹痉挛100%，而腹泻则少见，约33%。一般经过8～10h而治愈。腹泻型中毒由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在6h以上，一般为6～14h。中毒特点：腹泻96%，且腹泻次数多，腹痉挛75%，而呕吐却不常见，约为23%。病呈24～36h，两型均少见体温升高，愈后良好。致呕吐与腹泻毒素主要特征见表5-3-19。

5.3.7.5 细菌学检测

发生食物中毒时采取可疑食物或收集粪便及呕吐物进行检验。除进行分离培养外，须作活菌计数，因暴露于空气中的食物会在一定程度上受本菌污染，故不能因分离出蜡样芽胞杆菌就认为是食物中毒的病原菌。根据形态、染色、菌落特征（甘露醇—卵黄多粘菌素琼脂平板）及生化反应型、血清型和噬菌体分型作鉴定。蜡样芽胞杆菌的分离物应符合下述条件：①革兰氏阳性产芽胞大杆菌，其芽胞不突出菌体；②在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；③厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；④还原硝酸盐；⑤V-P阳性；⑥分泌L-酪氨酸；⑦在含0.001%溶菌酶的培养基中能生长。要鉴别典型蜡样芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌群的其他种还需进一步进行动力试验、根状生长试验、溶菌活性试验、和蛋白质毒素结晶试验，蜡样芽胞杆菌具有动力、强溶血、不形成根状菌落，或不产生蛋白质毒素结晶。

食品中该菌检验按照国家标准常规检验方法GB/T 4789.14—2010（图5-3-22）。

① 菌数测定 活菌计数是取样品25g（或25mL），用灭菌生理盐水225mL稀释后，分别制成1∶10、1∶100、1∶1000，取各稀释度0.1mL，接种在10%卵黄琼脂或MYP琼脂上，涂匀后，置37℃温箱中培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者计数。蜡样芽胞杆菌在卵黄琼脂上呈粉红色菌落，周围有乳白色混浊环。

计算后，从中挑取5个典型菌落作证实试验。根据证实试验为蜡样芽胞杆菌的菌落计算该皿内的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得每克（g）或毫升（mL）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。

② 分离培养 将检样或其稀释液接种于血琼脂或MYP琼脂平板，置37℃温箱培养12～20h，挑取可疑菌落接种于肉汤和营养琼脂做纯培养，以备证实试验用。

③ 证实试验 本试验包括形态观察，培养特性，生化性状：包括有动力、产生卵邻脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性；溶血，不发酵甘露醇和木糖；液化明胶，还原硝酸盐，在厌氧条件下发酵葡萄糖。

④ 动物试验 将蜡样芽胞杆菌的24h肉汤培养物接种于2只18～20g小鼠腹腔，每只0.3～0.5mL，于12～18h后死亡，由死鼠心脏血液可分离到该菌。

5.3.7.6 食品生产的综合控制

蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6～10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞生长繁殖，因而导致中毒。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡样芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。

5.3.8 金黄色葡萄球菌

5.3.8.1 食品卫生学意义

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为葡萄球菌属成员，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性公共卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多，1957～2012年我国发生106起，占所有细菌性食物中毒事件构成比6.93%（居第6位）。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对机体其他部位的污染。

另外，白色葡萄球菌（S.albus）和里昂葡萄球菌（S.lugdunensis）都引起过食物中毒，如2002年东莞某公司因四季豆炒猪肝引起40名员工里昂葡萄球菌食物中毒，以胃肠道症状为主，表现头痛、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发热等；2007年山东菏泽马岭岗镇某企业因吃白葡萄球菌污染熟牛肉引起食物中毒，13人发病，不同程度腹泻，发热。

5.3.8.2 主要特征

（1）形态及染色特征

典型的金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8～1μm，致病性葡萄球菌一般较非致病性为小。细菌繁殖时，呈多个平面的不规则分裂，堆积，显微镜下排列成葡萄串状（图5-3-23）。在培养基中，常呈双球或短链排列，容易误认为链球菌。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。易被一般碱性染料着染。

（2）生长要求及培养特性

金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，在20%二氧化碳环境中，有利于毒素产生。最适生长温度37℃，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1～2mm。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%～15%NaCl肉汤中生长。

① 普通琼脂 培养18～24h后，形成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的中等大菌落，直径一般为1～2mm。不同型的菌株产生不同颜色，使菌落呈不同的颜色。

Baird-Parker氏培养基上菌落为圆形、光滑、凸起、湿润，直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，菌落周围有一混浊带，在其外围有一透明带。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。非致病性菌无溶血现象。

② 普通肉汤 培养24h后，呈均匀混浊生长，2～3d后能产生菌膜，培养时间更长，则在管底形成多量黏稠沉淀物。

5.3.8.3 生化特性

可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。不产生靛基质，甲基红反应阳性，V-P反应弱阳性，许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。凝固牛乳，有时被胨化，MR阳性，能产生氨和少量硫化氢。

5.3.8.4 抵抗力

在无芽胞的细菌中，葡萄球菌的抵抗力最强。它具有较高的耐热性，70℃1h，80℃30min不被杀死，在干燥的脓汁中能存活数月。在5%石炭酸、0.1氯化汞（俗称汞）水中10～15min死亡。对某些染料极为敏感，尤其是龙胆紫，其1∶（100000～200000）的浓度即可抑制其生长。故临床上用1%～3%龙胆紫溶液治疗由本菌引起的化脓，效果很好。1∶20000洗必太、消毒净、新洁尔灭，1∶10000度米芬在5s内就可将其杀死。对青霉素、金霉素和红霉素高度敏感，对链霉素中等敏感。近年来因广泛使用抗生素耐药菌株逐年增多，目前金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药菌株高达90%以上，但这些耐药菌株对庆大霉素和先锋霉素是比较敏感的。

此外，本菌对磺胺类药物中等度敏感。对黄连、黄芩、紫花地丁、白头翁、金银花、连翘等中草药也较敏感。对氯化钠有较强的抵抗力，因耐高盐故常用含高浓度的食盐培养基分离本菌。

5.3.8.5 致病性

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：①溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起机体局部缺血和坏死；②杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；③血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；④脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌并间接推断是否为致病菌；⑤肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种经典血清型，C还可以分C₁、C₂和C₃。最新证实SEG-SET肠毒素样（SEL）毒素、U到X（SELU到SELX）、毒素休克综合征毒素-Ⅰ（TSST-1），共计23个分型，三个C型算做一类。共同特点是致呕毒性和超级抗原，动物实验没有致泻毒性。肠毒素形成条件：存放温度，在37℃基础上，温度越高，产毒时间越短；存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成，如乳类食品、肉类、鱼类和罐头等食品。肠毒素可耐受100°C煮沸30min而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。

葡萄球菌食物中毒是最急性的，特征是突然发病，来势凶猛。通常在进食有毒素的食物1～4h即发病，主要呈急性胃肠炎症状。剧烈的反复呕吐、恶心、急性腹痛，腹泻可能是继发引起的，严重者呕吐物和大便内有血液和黏液。通常在急性阶段就很快恢复（2～5h），但食欲和腹泻症状会持续1～2d，一般体温不高，这与沙门氏菌不同之处。年龄越小对毒素越敏感。

5.3.8.6 细菌学检测

金黄色葡萄球菌的检验可以根据形态、染色性、培养和菌落特征作鉴定，还可以进行血浆凝固酶试验和耐热核酸酶试验，金黄色葡萄球菌均为阳性。金黄色葡萄球菌肠毒素检测主要有动物试验、血清学试验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方法。

（1）国家标准检验方法（GB 4789.10—2010）（图5-3-24）

检样按图5-3-24检验程序进行增菌培养和分离培养，然后挑取可疑菌落做涂片染色镜检，观察溶血情况和血浆凝固酶试验，凡形态和菌落特征典型，溶血，血浆凝固酶阳性，即可报告为金黄色葡萄球菌。

血浆凝固酶试验：吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放在小试管内，再加入24h的葡萄球菌肉汤培养物0.5mL，振荡混匀，放（36±1）℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝块即为阳性。同时以已知的阳性和阴性葡萄球菌菌株及肉汤作为对照。

（2）耐热核酸酶的测定

葡萄球菌肠毒素特异抗血清的制备比较困难，而耐热核酸酶的最适pH9.0，与其他细菌的此类酶不同，可作为鉴定葡萄球菌的特性之一。

① 细菌培养物的耐热核酸酶的测定 甲苯胺兰核酸琼脂的配制：

0.05mol/L trispH9.0缓冲液　 1000mL

脱氧核糖核酸　　　　　　　0.3g

琼脂　　　　　　　　　　　10g

0.01mol/L CaCl₂　　　　　　1.0mL

氯化钠　　　　　　　　　　10g

以上混合物煮沸到琼脂和脱氧核糖核酸完全溶解，稍后加入3.0mL 0.1mol/L甲苯胺兰，分装小瓶或试管，用橡皮塞塞紧后置冰箱，至少可用一年。

在干净的玻片上加注3mL熔化的甲苯胺兰核酸琼脂。凝固后用2mm直径的打孔器，每片打4～8个孔。每孔加入煮过的培养物一小滴。放37℃3h，看粉红色圈大小。同时滴加未接种的培养物和其他细菌的培养物做对照。

② 食品中耐热核酸酶的测定 取食品20g加水40mL，搅拌成匀浆，调pH4.5后低温离心15min，抽取上清液，加入3mol/L三氯醋酸，低温高速离心15min，倾去上清液，溶解沉淀，调pH至8.5，煮15min，冷却。将处理液加入到小孔中，放37℃孵育3h，琼脂板小孔周围出现粉红色为核酸酶阳性。灵敏度为0.005g/mL，金黄色葡萄球菌生长到50万～100万个/g即能测出核酸酶。

5.3.8.7 食品生产的综合控制

（1）防止金黄色葡萄球菌污染食品

防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。

防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。

对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。

（2）防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成

在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6h，并且食用前要彻底加热。

5.3.9 肉毒梭菌

5.3.9.1 食品卫生学意义

肉毒梭菌（Clostridium botulinum）为厌氧芽胞杆菌属成员，为严格厌氧菌，是一种腐物寄生菌，在自然界中分布广泛，遍布于土壤、江、河、湖、海沉积物等中，水果，蔬菜，畜、禽、鱼制品中亦可发现，偶尔见于动物粪便中。一般认为土壤是肉毒梭菌的主要来源。在我国肉毒中毒多发地区的土壤中，该菌的检出率为22.2%，未开垦的荒地土壤带菌率更高。污染食品主要存在于密闭比较好的包装食品中，在厌氧条件下，产生极其强烈的肉毒毒素（botulinus neurotoxins，BoNTs），其毒性作用是目前已知化学毒物和生物毒素中的最为强烈的一种，比氰化钾的毒力还大10000倍。小鼠LD₅₀为0.001μg/kg，对人的致死量为10^-9mg/kg，0.072μg即可致一成年人死亡。肉毒梭菌中毒症简称肉毒中毒。1896年Van Ermengem从保存不良的熏火腿中和死于此病的一个病理组织中发现该病病原体。我国于1958年发现人发生本病，是世界上发病数最高的国家。人类肉毒中毒可分为四种类型：食物性肉毒中毒（即毒素型肉毒中毒）；婴儿肉毒中毒；创伤性肉毒中毒；吸入性肉毒中毒。我国主要存在的是食物性肉毒中毒，其中以A、B和E型毒素中毒较为常见，F型较少；L型毒素所表现的毒性作用往往较M型毒素为大。肉毒中毒集中发生在北纬30～70度区域内，在毒素型别上具有地域性差别，美国主要为A型，欧洲为B型，日本为E型。在国外，引起肉毒中毒主要的食品多为肉类及各种鱼类及鱼肉制品，火腿、腊肠，以及豆类、蔬菜和水果罐头，在蜂蜜食品中也有发现。中毒食品种类往往与饮食习惯有关。如欧洲各国主要的中毒食品为火腿、腊肠和其他兽肉、禽肉等。美国主要是家庭的水果罐头，而火腿、腊肠等畜禽加工食品仅占7.7%。前苏联和日本的鱼制品中毒者最多，尤其是日本，几乎全部是鱼制品的E型中毒。在我国也有肉毒中毒的报导，由肉类食品及罐头食品引起中毒的较少，据新疆肉毒科研协作组的223起肉毒中毒的调查统计，由于臭豆腐、豆豉、面酱、红豆腐、烂土豆等植物性食品引起中毒事件共有204起，占91.48%；其余的19起是动物性食品，包括熟羊肉、羊油、猪油、臭鸡蛋、臭鱼、咸鱼、腊肉、干牛马肉等。由于诊断手段趋于完备，我国肉毒中毒的发现面越来越广，迄今至少已殃及20个省区。新疆基本上都是A型，有少数B型。而其他省区除有少数A型和个别地区的E型外，均为B型。表明我国肉毒中毒的型别具有某种地域倾向性。尤其E型肉毒中毒在我国更显示出与国外不同的特征。我国E型肉毒中毒发现较晚，第一例是1965年发生于吉林省磐石县的一起臭豆腐引起的食物中毒。这是全国首次发现的E型肉毒中毒。肉毒中毒虽然中毒发生较少，但致死率高，人类如食用了该毒素污染的食品可引起严重的肉毒中毒，如果不及时治疗死亡率高达70%。

5.3.9.2 形态及染色特征

肉毒梭菌为革兰氏阳性的粗大杆菌，长4～6μm，宽0.9～1.2μm。多单在，偶见成双或短链，菌体两端钝圆。周身有4～8根鞭毛，能运动，无荚膜。芽胞偏短为椭圆形，A与B型的芽胞大于菌体，位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状；C及另外四型菌的芽胞一般不超过菌体宽度D，4～8根周毛，运动力弱（图5-3-25、图5-3-26）。

5.3.9.3 生长要求及培养特性

该菌为严格厌氧菌，生长发育时为厌氧或兼性厌氧，对营养要求不高，在普通培养基上就可以生长。在食品中于适宜条件下（无氧、20℃和必要的营养物质）可大量繁殖，产生一种以神经毒为特征的可溶性强烈毒素。生长发育最适温度为28～37℃，pH6.8～7.6，产毒最适pH为7.8～8.2。20～25℃A和B型肉毒梭菌形成大于菌体、位于菌体次末端的芽胞。当pH低于4.5或大于9.0时，或当环境温度低于15℃或高于55℃时，肉毒梭菌芽胞不能繁殖，也不产生毒素。

血清琼脂或普通琼脂：培养48～72h，形成中央隆起、边缘不整齐、灰白色、半透明、表面粗糙的绒球状菌落，呈绒毛状、向外扩散的菌落。直径可达5～10mm。

血液琼脂：菌落周围有溶血区。

肉渣肉汤：呈均匀混浊生长，肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭气味，从第三天起，菌体下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基中，大量产气。

5.3.9.4 生化特性

本菌生化特性很不规律，一般能分葡萄糖，麦芽糖、果糖产酸产气。对明胶、凝固蛋白均有分解作用，并引起液化。不形成靛基质，能产生硫化氢，但因型、株不同而有差异（表5-3-20）。

肉毒梭菌根据其毒素的免疫学特性，可分为A～G七个毒素型，C型包括C₁和C₂两个亚型。引起人食物中毒的主要是A、B、E及F型，C₂和D型主要对家畜致病，C₁型主要引起野水禽中毒。

我国A、B、E三型均有发生，但以A、B型为主，E型有资料记载的只发生7起。各型毒素基因序列有很高的同源性，且与破伤风毒素基因有较高的同源性，但其同源程度有一定的差异，可达31.6%～98.1%不等。各型之间抗原性不同，其毒性只能被相应的抗毒素所中和。肉毒梭菌按其生理特征还可分为三个群：Ⅰ群为蛋白分解性，能水解凝固蛋白质，其菌株培养最适温度为35℃，包括A、B和F型；Ⅱ群为非蛋白分解性，不能水解凝固蛋白质，其菌株培养最适温度为26℃，包括E、B和F型；Ⅲ群包括C和D型，也为非蛋白分解性。

5.3.9.5 抵抗力

肉毒梭菌的抵抗力一般，所有菌株在45℃以上都受到抑制，加热80℃20～30min或100℃10min可将其杀死。但其芽胞的抵抗力很强，可耐煮沸1～6h，于180℃干热5～15min，或121℃高压蒸气10～20min，或100℃5h才能杀死芽胞，10%盐酸须经1h才能破坏，在酒精中能存活2个月。其中以A、B型菌的芽胞抵抗力最强。这一点对于罐头食品的灭菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽胞。肉毒毒素虽然是蛋白质，但抵抗力也很强，80℃30min或100℃10min才能完全将其破坏。正常胃液和消化酶于24h不能将其破坏，可被胃肠道吸收而中毒。蛋白分解性的肉毒梭菌芽胞比非蛋白分解性的肉毒梭菌芽胞对热具有更强的抵抗力，如A型菌芽胞加热100℃360min或120℃4min方可被灭活，而E型菌80℃20min才能被杀灭。

5.3.9.6 致病性

肉毒梭菌的致病性主要是其产生的肉毒毒素引起。正常情况下，肉毒梭菌在机体内不能生长繁殖，即使进入人和动物消化道，亦随粪便排出。在适当营养的厌氧环境中，可生长繁殖并产生肉毒毒素。肉毒毒素是迄今已知毒物中最毒的一种，极微量即可引起人的死亡，据估计人的最小口服致死量为（5×10^-9）～（5×10^-6）mg/kg（对人的最小致死量为0.1μg）。毒素进入体内后，在正常胃液中，24h不被破坏，大部分在小肠上部被吸收，通过淋巴管和胸管进入血循环，选择性地作用于运动神经与副交感神经，主要作用点为神经末梢和神经肌肉交接处，抑制神经传导介质——乙酰胆碱的释放，因而使肌肉发生弛缓性瘫痪。生理学研究已经证明，肉毒梭菌毒素对突触结构电位活动、突触内外离子浓度、突触后结构均有影响。可阻止神经细胞内外离子交换，阻断Ca⁺⁺诱导的囊泡分泌作用，从而不使乙酰胆碱释放出来；神经细胞内Ca⁺⁺浓度明显下降，突触囊泡对Ca⁺⁺的敏感性下降；终板区胆碱酯酶活力明显下降，而且电镜下观察可发现神经肌肉接头处出现新的运动终板或神经分布。肉毒神经毒素是一种锌肽链内切酶，它的作用底物为神经末梢突触膜突触小泡的内膜蛋白Synaptobrevin-2，此蛋白主要负责运输神经介质，经内切酶（即毒素）作用后，即毒素作用于胆碱能神经末梢的突触，通过毒素的重链与突触前膜毒素受体-神经节苷脂的结合，肽链被切断，不能识别神经介质，失去了运输神经介质的能力，从而抑制乙酰胆碱的释放，妨碍神经冲动的传导而引起肌肉松弛性麻痹和神经功能不全。

临床观察表明，A型肉毒中毒比其他型可引起更严重的病症和更高的死亡率，因此，对A型及其他型肉毒毒素中毒防治具有更重要意义。作为人类的致病原，A型肉毒毒素受到了极大关注。引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品，这些食品是在调制加工、运输贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下发芽，增殖并产生毒素所造成的。肉毒毒素中毒潜伏期长短不一，短者可2h，长者可数天，一般为12～24h。中毒症状，早期为瞳孔放大、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说话和吞咽困难，通常还可见到呼吸困难。体温一般正常，胃肠道症状不明显。病程一般为2～3d，也有长达2～3周之久。肉毒中毒死亡率较高，据报道可达30%～50%。死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌瘫痪。如早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至10%～15%。

毒素的形成是先在菌体内合成前体毒素，前体毒素多以多种复合体的形式表现。菌体裂解释放至细胞外时再被蛋白酶活化而成。在pH7.2或以上条件处理前体毒素，则毒素的毒性成分被分离出来，即毒素衍化物。毒素衍化物由两条多肽链组成，即重链和轻链，两肽链彼此由一个或一个以上的二硫键相连接。肉毒梭菌繁殖和毒素产生随pH值下降，通常在pH4.6以下停止。

肉毒毒素均为大分子蛋白质，为不耐热毒素，抵抗力较强，加热80℃30min或煮沸10～20min可破坏其毒性。A型毒素由19种氨基酸组成，为含有神经毒蛋白和红细胞凝集素两种抗原的不同蛋白质复合体，B、E、F各型均含有神经毒和无毒蛋白两种成分。液体毒素需煮沸15～20mim，固体中则需要2h才被破坏。

现已公认，任何型的毒性成分都是作为单一多肽链被产生的，但蛋白分解酶，不管是内源或外源性的能把毒素切割为双链而显示其毒性。重链与细胞受体结合，轻链进入细胞内发挥毒性作用。被切毒素的两个多肽链间至少有一个二硫键连接，二硫键的作用在于维护毒素的完整及其毒性。用木瓜蛋白酶处理重链可降解为B和C两个片段，其中C片段对动物无毒性，但却具有较好的免疫原性，B片段有一定的毒性；轻链毒性更大，因此只有重链C片段（BoNTaHc）可作为免疫原。A、B、C、D、E和F型神经毒素分子的氨基酸序列已经测出。目前已知，每一血清型神经毒素的N末端残基均为脯氨酸残基。每型蛋白分子的38～43位氨基酸之间存在有亮氨酸-酪氨酸残基对。A型肉毒毒素是最早制成的结晶毒素，是由19种氨基酸所构成的蛋白质。A型肉毒毒素由染色体基因编码，全长3942bp，分轻链和重链区两部分。A型肉毒毒素的相对分子量约150kDa，此毒素首先以单链形式合成，然后被蛋白酶在N端1/3处分割为由二硫键连接的两条单链：轻链L和重链H，轻链50kDa，重链100kDa重链的N末端是最保守的区域。A型肉毒毒素神经毒位点在重链上。轻链和重链在分开、分离时它们的构型并无明显的不可逆变化，再连接的双链重新获得毒力。

肉毒毒素A、B、C、D、E、F抗原性各不相同，具有广泛的异质性。肉毒毒素具有与破伤风毒素很多相似之处：①超强毒性，人的LD₅₀为0.1～1ng/kg；②多肽单链以无毒性菌体毒素形式合成；③被蛋白酶水解激活后成毒性蛋白，具有活性的神经毒素为两条亚单位链，两链以二硫键相连。肉毒梭菌本身缺乏相应的蛋白酶，菌体产生的神经毒素首先是以单链形式释放出来，毒性低，被机体摄入后，由宿主的蛋白酶水解而成具有毒素活性的双链结构构型。肉毒毒素B的分子结构为典型的三叶草构型，中间部分（Hc）为跨膜区，两侧分别为细胞结合区（HN）和催化活性区（毒性区，L）（图5-3-27）。

C₂毒素是C型肉毒梭菌产生的一种非神经毒素，在结构和功能上与神经毒素完全不同。它属于一种细胞毒素。胰酶激活C₂的毒素的适宜pH为7.5～8.0，比激活E型毒素的pH明显高。C₂型毒素毒力（致死性、红斑和血管通透性）由两种免疫学蛋白成分诱导，组分Ⅰ分子量为55ku，具有ADP核糖基酶活性；组分Ⅱ为105ku，具有介导细胞结合和运转功能，将组分Ⅰ运送至细胞内，使G—肌动蛋白在Arg-177处发生ADP核糖基化，而引起G肌动蛋白单纤维聚合。

5.3.9.7 细菌学检测

肉毒梭菌的检验以检测肉毒毒素为重点，肉毒梭菌菌体的检查一般意义不大，因为自然界和人畜肠道平常就有肉毒梭菌存在，如果首先做细菌培养即使得到阳性结果，也不宜对中毒作出肯定的诊断。只有检出毒素，才能争取时间，判明毒素类型，采取有效措施，防止食物中毒。如果目的是为了证实肉毒梭菌的存在，如罐头食品的细菌学检验或细菌分布调查，就要进行一系列细菌学试验。但最终还是要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别。所以，肉毒毒素的检出被看做是肉毒中毒实验室诊断的最根本方法。检验按国家标准检验法（GB/T4789.12—2003）进行。

（1）肉毒梭菌的常规检验方法

检样经均质处理后，及时接种培养，进行增菌、产毒培养，同时进行毒素检测试验。毒素检测试验结果证明有无肉毒毒素及有何型毒素存在。对增菌培养物一方面做一般的生长特征观察，同时检测肉毒毒素的产生情况。肉毒毒素的检测在实验室中一般采用生物学方法，常用的有小白鼠肉毒毒素检测实验和毒素中和实验。将可疑液体样品的离心上清或固体样品的浸出液腹腔注射小白鼠，如样品中含有肉毒毒素，则注射后24h内小白鼠发病死亡。被检样品与等量多型混合抗毒素或单型抗毒素分别混合，中和作用后腹腔注射小白鼠，根据小白鼠发病死亡或保护情况，可以鉴定出肉毒毒素的型别。

① 检样的采集 可疑肉毒中毒时，要及时收集可疑食品，如无可疑食品可采患者的呕吐物或其洗胃液，若患者血中疑有毒素，可采集血液。

② 检样处理 肉毒毒素在偏酸的溶液里尤其在含明胶的溶液中比较稳定，故一般最好用pH6.2～6.8的明胶磷酸盐缓冲盐水稀释检样。对固体、膏状、半流体状样品，如肉块、土壤、尸体的内脏、病人呕吐物及其粪便、豆酱、臭豆腐及其他各种固体食品或牲畜饲料等，称取所需量，加入5～10倍量（按容量计）的上述稀释剂等。

（2）肉毒毒素检测

将上述稀释的检样经浸泡、研碎、离心；液体检样可直接离心，取上清作检测。另取部分上清液，调pH6.2，每9份加10%胰酶（活力1∶250）水溶液1份，并不断轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。以小白鼠腹腔注射法为标准法。

① 检出试验 取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠2只，0.5mL/只，观察4d。液中若有肉毒毒素，小白鼠一般多于24h内发病死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软，呼吸困难呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如小白鼠猝死，或症状不明显时，可将注射液适当稀释，重作试验。

② 确证实验 不论上清液或其胰酶激活处理液，凡不能致小白鼠发病、死亡的，取待检样分成3份做试验。1份加等量多型混合肉毒抗毒素诊断血清，混匀，37℃作用30min；1份加等量明胶盐酸缓冲液，混匀，煮沸10min；1份加等量明胶盐酸缓冲液混匀，不作其他处理。3份加混合液分别注射小白鼠各2只，0.5mL/只，观察4d，若注射加诊断血清与煮沸加热2min混合液的小白鼠均存活，而注射未经处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，即可判定检样中有肉毒毒素，必要时可进行毒力测定及定型。

③ 毒力测定 将判定含有毒素制备液上清，用明胶磷酸盐缓冲液稀释5×10¹～5×10³；各稀释度注射两只小鼠，每只0.5mL，观察4d。可根据稀释剂量判断其毒素含量。

④ 型试验 根据毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大约在（10～1000）LD/mL（5、50、500倍稀释全部死亡，5000倍稀释全部存活）的范围，分别与各单型肉毒抗毒素血清等量混合，37℃作用30min，各注射小鼠2只，每只0.5mL，观察4d。应同时作阴性对照。能保护动物免于发病、死亡的血清型别，即为检样中所含有肉毒毒素的型别。

（3）肉毒梭菌检验 作增菌产毒培养试验：取疱肉培养基3支，煮沸10～15min除氧，再做如下处理：

第一支：急速冷却，接种检样均质液1～2mL；

第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min，急速冷却；

第三支：接检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。以上接种物于30℃培养5d，若无生长，继续再培养10d。到期若有生长，取培养液离心，取上清液作毒素检测，方法同前，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌。

分离培养：亦可将检样匀质液接种于明胶琼脂半固体培养基和TPGYT中。接种后的培养基于30～37℃厌氧培养4～5d。若无菌生长。继续培养同样时间有肉毒梭菌生长，培养基混浊，并显著产气，染色镜检可见到革兰氏阳性两端钝圆的大肠杆菌，芽胞位于菌体近端，宽于菌体。有肉毒梭菌生长的，要进行毒素测定，将培养液离心，取其上清检测，方法同前，应做到定型。

选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。该菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及其周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，但G-型菌无这些现象。

根据菌落及菌体形态挑可疑菌落，接种庖肉培养基，于30℃培养5d，作毒素检测，方法同前；并作培养检查确证试验：接种卵黄平板，分成2份，分别于37℃需氧和厌氧条件下48h，观察生长情况及菌落特征。

肉毒梭菌及其毒素检验程序如图5-3-28所示。

（4）其他快速检测方法

食品中的肉毒毒素检测除常规生物学方法外，还有免疫学方法、PCR方法、基因探针法、自动化检测等。免疫学方法包括沉淀反应、颗粒吸附试验、固相放射免疫试验（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹等方法。目前沉淀反应、固相吸附血凝法、ELISA技术、免疫印迹等均用于检测肉毒梭菌和肉毒毒素的检测。DNA探针和PCR技术不仅可以特异性检测所有肉毒毒素基因，而且可以针对不同型毒素基因进行分型检测和鉴定，或结合ELISA方法进行检测。2001年Lindstrom利用合成的相同或相近退火温度的4对特异性引物对食物和粪便中的A、B、E、F型肉毒梭菌进行了多重特异性神经毒素基因扩增检测，结果显示该方法具有良好的特异性和极高的敏感性。Patrick（1995）参照BoNTA、B、E、F、G重链C末端编码基因保守序列人工合成一组复合DNA引物，进行了PCR扩增，五种产毒素菌株均获得了预期的260bp片段，同时利用各种毒素的DNA特异性探针对所扩增的片段进行了分型检测与比较，结果证明PCR方法结合核酸探针杂交方法检测几种毒素基因具有灵敏度高、特异性强的特点。国内亦有研究者利用多重PCR检测A、B、C、D、E、F型肉毒毒素基因。2001年有研究者采用免疫-PCR技术用于A型毒素的检测，可以检测到10CFU/mL的菌体。另外，先期发展的单克隆抗体技术得到的各型神经毒素单克隆抗体用于ELISA方法不仅可以检测各型神经毒素，并且可以进行细菌分型；ELISA和PCR方法联合应用也广泛应用于食品中肉毒梭菌及神经毒素的检测。近年来发展的生物传感器技术在细菌毒素检测方面显示了巨大生命力，1995年Gatto-menking等利用免疫磁性电化学发光传感器检测肉毒毒素等获得成功，灵敏度可达到纳克（ng）水平。我们也用毒素单链抗体形式检测，获得了较好效果。

5.3.9.8 食品加工过程中的综合控制

肉毒中毒的预防措施包括：①防止肉毒梭菌污染食品：食品制作的原料应新鲜，充分洗净并灭菌，食品的制作、烹调、加工所需器具、器材等应洗净后灭菌；②对食品进行灭菌：防止肉毒梭菌生长繁殖，罐头、罐装食品等真空食品，必须严格执行《罐头厂卫生规范》（GB 8950—1988），罐装后要彻底灭菌，其中心温度须经120℃4min以上彻底灭菌；对有肉毒梭菌增殖危险性的 仅有10起报道，中毒人数4018人，涉及牛肉、马肉、鸡食品，应严格遵守低温保存和运输的规定，如鱼、肉、火腿、腊肠等，须在10℃以下，通风凉快的地方保存，避免加工后的再污染；在储藏过程中有产气膨胀的罐头时，不能食用；③进食前充分加热：加热80℃ 30min或100℃10～20min可破坏毒素，因此，对可疑食品彻底加热是预防肉毒中毒的可靠措施。另外，有针对性地进行宣传教育，改革家庭食品传统的制备方法及饮食习惯，也是杜绝肉毒中毒的有效措施。

5.3.10 魏氏梭菌（Clostridium welchii） 

5.3.10.1 食品卫生学意义

魏氏梭菌（Clostridium welchii）又称产气荚膜梭（杆）菌（C.perfingens），为厌氧芽胞杆菌属成员。它在自然界分布广泛，在空气、灰尘、土壤、垃圾、污水中都存在，在人和动物的肠道内也经常发现，据报道健康人的肠道内带菌率2%～15%，动物粪便检出率1.7%～18.4%，土壤的分离率可达50%，在猪、鼠的粪便中约有20%能找到本菌。魏氏梭菌属条件致病菌，能引起多种动物发病，是近年来我国大量发生的“家畜猝死症”的主要病因之一，是人和动物创伤（急性）感染（气性坏疽）的重要病原菌，也是比较常见的一种食物中毒菌。可引起人的食物中毒和非食源性胃肠道疾病，如抗生素相关性腹泻（ADD）和散发性腹泻。近年来的研究结果发现，并不是所有的魏氏梭菌都对人有致病性，只是能够产生肠毒素的魏氏梭菌才对人致病。魏氏梭菌污染食品后，其产生的肠毒素和外毒素可引起食物中毒，特别在美国和英国，被认为是当前最重要的三种食物中毒菌之一。在美国每年将占食物中毒患者总数的30%左右，我国发生较少，肉、鸭肉、狗肉、卤肉各一起，发病率大约49%，其他情况统计不详。国外引起此类食物中毒的食品多为鸡、兔和其他肉类，据调查在猪肉及牛肉检出率为15%～20%。因其芽胞耐热，经过一定的温度加热，并不能被完全杀死，芽胞在熟肉的贮存过程中，在适宜的温度下会大量繁殖，产生毒素，人们食用后即可引起食物中毒。魏氏梭菌食物中毒一般多由A型菌引起，其次是F型。有人报道，魏氏梭菌食物中毒的症状出现一般需要10⁸个以上的活菌数。A型魏氏梭菌食物中毒，其潜伏期为10～12h，最短的6h，长的达20h。临床症状为急性胃肠炎，有腹痛、腹泻，伴有发热和恶心，病程较短，多数在一天内即可恢复。F型所引起的中毒症状较严重，潜伏期短，其症状表现严重的下腹部疼痛，重度腹泻，粪便中有血液，严重者常引起脱水和循环衰竭而死。

5.3.10.2 主要特征

魏氏梭菌是一种革兰氏阳性粗大杆菌，为梭状芽胞属条件致病菌。菌体长4～8μm，宽0.8～1.0μm，两端钝圆，单在或成双排列，也有成短链排列者。芽胞呈卵圆形，小于菌体，位于菌体中央或次极（近）端。在机体内可形成明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。厌氧培养时一般很少形成芽胞。在陈旧的培养物中，菌体往往呈革兰氏阴性（图5-3-29～图5-3-32）。

5.3.10.3 生长要求及培养特性

本菌为厌氧菌，但对厌氧条件并非十分严格，生长繁殖的温度范围广（20～50℃），在40mm水银柱压力的氧张下仍能生长，对营养要求不高，在一般普通培养基上均能生长。菌落半透明，表面光滑，边缘整齐。在血琼脂平板上，多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血是θ毒素的作用所致，外环不完全溶血则是α 毒素所引起。在蛋黄琼脂平板上，该菌产生的α 毒素可分解蛋黄中的卵磷脂，使菌落周围出现乳白色浑浊圈，这一现象称为Nagler反应，是一种简易的鉴定细菌并测定该菌是否产生α 毒素的方法。若在培养基中加入α毒素的抗血清，则菌落周围不出现乳白色浑浊圈。

普通琼脂：呈灰白色不透明、表面光滑、边缘整齐的菌落，直径为2～5mm。

亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶（SPS）琼脂：圆形、表面光滑的黑色菌落。

葡萄糖血清琼脂：形成中央隆起或圆盘样的大菌落，菌落表面有放射状条纹，边缘锯齿状、灰白色、半透明，外观似“勋章”样。

血琼脂培养基：形成灰白色、圆形、边缘呈锯齿状的大菌落，周围有明显的β形溶血环。

肉渣培养基：发育迅速，肉渣变成红色，并产生气体。肉渣不被消化。

肝片肉汤：发育迅速，5～6h后即变混浊，并产生大量气体。

牛乳培养基：培养8～10h后，能分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固，同时产生大量气体。冲散凝固的酪蛋白，使之变成海绵状，气势凶猛，被称为“汹涌发酵现象（stormy fermentation）”（图5-3-33）是本菌的特点之一，可用于快速诊断。

图5-3-33 魏氏梭菌在牛乳培养基中的汹涌发酵现象

5.3.10.4 生化特性

本菌对糖的分解作用极强，大多数的糖，如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、半乳糖、棉子糖、淀粉、糊精、甘油等可被分解，产酸产气，不分解菊糖、甘露醇及杨苷。在疱肉培养基中也因分解肉渣中的糖类而产生大量气体，能缓慢液化明胶。产生硫化氢，不产生靛基质。对凝固蛋白及血清无消化能力。该菌在牛乳培养基中产生汹涌发酵现象是本菌具有特征性的生化试验。与其他梭状芽胞杆菌的生化鉴别见表5-3-21。

5.3.10.5 抗原结构及血清型

用凝集反应不能区分出明显的菌型，表现出抗原的重叠性，而凝集原与可溶性抗原鉴定的菌型之间没有明显关系。熟知的可溶性抗原有α、β、γ、η、δ、ε、ι、θ、κ、λ、μ和ν12种，其性状和分布见表5-3-22。这些可溶性抗原都是蛋白质，分子量大约在4kDa以上，其中α、β、ε和ι是主要致死毒素，也是主要的抗原。魏氏梭菌根据其产生的主要致死性毒素α、β、ε和ι与其抗毒素的中和试验分成A、B、C、D和E五个型。另外还提出一个第六型，F型，现在则认为它是C型，从而放弃了F型的名称。对人致病的主要为A型，引起气性坏疽和食物中毒。C型中有些菌株可引起坏死进行性肠炎。其他型别则在动物中引起腹泻和肠炎等。魏氏梭菌的这五个型，根据细胞或菌落形态，生化反应或最终代谢产物脂肪和有机酸的气-液色谱分析，是不能确实区别的，确实分型需用毒素来确定。魏氏梭菌按毒素型分类见表5-3-23。

5.3.10.6 抵抗力

在含糖的厌气肉肝汤培养物中，因产酸几周内菌体即可死亡，而在无糖厌气肉肝汤培养物中菌体能生存几个月。芽胞在90℃ 30min，100℃ 5min死亡，而食物中毒型菌株的芽胞，能耐煮沸1～3h。魏氏梭菌肠毒素为分子量较低的蛋白质，分子量为3.6ku左右，对热抵抗力不大，在50μg/mL时，加热55℃ 88min，57℃ 37min，60℃4min，可破坏其间接血凝反应性，100%灭活，加热100℃立即灭活。对碱有抵抗力，在pH10以内不被破坏，对酸抵抗力则较小，在pH4以下立即被破坏。

5.3.10.7 致病性

魏氏梭菌在自然界分布比其他梭菌更为广泛，其致病性也较为广泛。魏氏梭菌能产生多种强烈的外毒素和酶类，如致死毒素、坏死毒素、溶血毒素及肠毒素、卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶、明胶酶和脱氧核糖核酸酶。这些致病物质与组织分解、坏死、产气、水肿及病变扩散和全身中毒症状有关。在形成芽胞的同时产生一种引起肠膨胀的物质称为肠毒素，并推断为食物中毒的起因。根据魏氏梭菌形成毒素及动物致病性的特点，目前可将本菌分为六型，即A、B、C、D、E和F，对人致病的主要是A型和F型，其他四种主要对各种动物呈现致病作用。引起食物中毒的主要是A型，其次是C型。魏氏梭菌的毒性物质分为12种（表5-3-22）。魏氏梭菌产生的毒素尤其是α、β、ε和ι 四种主要致死性毒素，具有良好的免疫原性，制成类毒素后具有良好的防病作用。

A型菌主要是人气性坏疽和人食物中毒的病原菌，也引起动物的少数气性坏疽病例，A型菌产生各种毒素，动物的病理过程与这些毒素的活性有关，α 毒素破坏细胞壁，使组织死亡，增强血管通透性，引起水肿等。引起食物中毒A型菌还产生肠毒素，而气性坏疽的病原菌则不产生肠毒素。A型食物中毒其潜伏期一般在10～12h，最短为6h，长的达24h。临床症状为急性胃肠炎，有腹痛、腹泻（呈水样便或带黏液及血液的大便），伴有发热和恶心，病程较短，多数在一天内即可恢复。C型所引起的中毒症状较严重，潜伏期较短，其症状表现严重的腹部疼痛、重度腹泻，粪便中有血液及黏液，严重者常可引起严重脱水和循环衰竭而死亡。

魏氏梭菌肠毒素二级结构80%为β折叠，20%为无规则卷曲。该蛋白毒素含有319个氨基酸，Lawrence等对肠毒素的氨基酸末端的基本结构分析发现，这20个氨基酸残基序列与已报道的蛋白序列之间在化学结构上没有太大的相似性，肠毒素具有如下独特的基本结构：1Met-2Leu-3Ser-4Asn-5Asn-6Leu-7Asn-8Pro-9Met-10Val-11Phe-12Glu-13Asn-14Ala-15Lys-16Glu-17val-18Phe-19Leu-20Iie。Michael等对肠毒素的N端的66个氨基酸序列进行研究后认为该区中存在两个胰酶活化位点，它们分别是15LyS16Glu和LyS25-Thr。

魏氏梭菌肠毒素对热和pH均不稳定，对蛋白酶敏感，对胰蛋白酶不敏感。魏氏梭菌肠毒素（CPE）具有与别的肠毒素不同的独特作用方式，可以与抗毒素产生免疫反应，发生中和作用，但其生物学活性却不能被A、B、C、D、E定型诊断血清所中和。研究结果表明，采用CPE特异性抗体能够使A型魏氏梭菌引起的食物中毒症状消除。

① CPE作用的分子机理 CPE给人、猴、狗等口服时，能引起腹泻，能使羊羔及家兔的结扎肠道膨胀，对小白鼠有致死作用，对豚鼠皮内注射，能引起红肿反应。用肠毒素处理鼠的回肠，可引起与吸收过程相反的物质运输，大量分泌液体，NaCl丢失。肠毒素首先与靶细胞膜上的特异受体结合，继而破坏细胞表面的结构，导致胞内物质渗漏，并影响细胞的代谢，最终导致细胞的死亡。有研究结果证实，将毒素加至单层Vero细胞液中，30min内即可见细胞结构损伤，大量的空泡聚集在细胞浆的膜面，35～40min细胞存活率下降50%。CPE具有潜在细胞毒活性主要包括肠黏膜通透性改变、新陈代谢紊乱、组织学损伤以及细胞内的大分子合成于肠毒素接触后的30min内完全受到抑制，最终导致肠黏膜的损伤而发病。

CPE能够迅速作用于十二指肠、空肠和回肠引起组织损伤，小肠对CPE最为敏感，出现严重的组织损伤。CPE引起小肠组织病理变化的分子机理的研究，主要是通过电镜对CPE处理的家兔肠上皮细胞的观察获得的，肠细胞经CPE处理后，CPE很快在细胞膜刷状缘上出现可见肠黏膜损伤，CPE是一种对细胞膜具有活性的毒素，而且它能够迅速地改变正常哺乳动物细胞的膜通透性。这种通透性的改变最初仅限于分子量在200kDa以下的小分子物质通过，从而导致细胞胶体渗透压平衡的破坏，使细胞裂解或使细胞的基础代谢过程受到抑制，从而引起细胞的死亡。目前已研究清楚CPE引起细胞膜通透性的改变是一个独特的多步骤的过程，首先，CPE与一种肠道上皮细胞的蛋白质受体结合，形成小分子复合体，大小为40～50ku，然后小分子复合体会与其他蛋白进一步在细胞膜上形成一种更大的包含有CPE的二级复合体，约160ku大小，这种大分子复合体则引起通常所见的细胞膜通透性的改变。目前已知各种大分子复合体中至少还包括一种45～50ku真核生物蛋白及另一种65～70ku的真核生物蛋白。而且各种大分子复合体能在细胞膜上形成一种孔状结构，细胞膜能够充分保护其免受蛋白酶的作用。这种保护效应是由于位于大分子复合体的CPE插人细胞膜的脂双层，形成了细胞膜孔道。

② CPE的作用对Ca²⁺有依赖性 Moribiro等用纯化的肠毒素（20～200ng/mL）对Hela细胞和Vero细胞进行作用，在有Ca²⁺存在的情况下均能使细胞有小泡形成，但当不加Ca²⁺时则无此作用。由此推测，肠毒素的生物学作用包括两个相互衔接的过程，第一步是温度依赖阶段，不需Ca²⁺参与，主要是肠毒素与细胞的结合，一般结合30～60min后，将无法从细胞上洗脱肠毒素；第二步是Ca²⁺依赖阶段，最终导致细胞上气泡和气囊形成。EDTA、胰酶处理不会影响细胞对毒素的敏感性，但蔗糖的存在能推迟这些生物学作用的出现，并对毒素作用有部分的抑制。

③ CPE具有超抗原性 Paul等用CD⁸⁺流感特异性细胞毒T细胞系（CTL），筛选出能诱导人组织相溶性白细胞抗原二类（class Ⅱ）阳性靶细胞溶解的候补超抗原（candidate super antigen）。魏氏梭菌肠毒素主要诱导一些（非全部）CTL细胞复合性地非限制性杀伤组织相溶性白细胞二类抗原阳性靶细胞，采用“锚”聚合酶链反应证明CPE选择性地刺激5位正常供体的含T细胞Vβ6.9和Vβ22受体的外周血淋巴细胞，对Vβ24、Vβ21、Vβ15和Vβ6的刺激作用则很小，抗原并不需要加工过程，CPE即可诱导细胞增殖。肠毒素的超抗原性与其生物学特性可能是紧密联系的。

5.3.10.8 细菌学检测

食品中魏氏梭菌检验主要目标是食品被该菌污染的程度，检验重点项目包括细菌计数及确证试验（图5-3-34）。

依据《GB 4789.13—2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》：

（1）活菌计数

培养以无菌操作取食品检样25g（mL）放入均质器中，加0.1%蛋白胨水稀释剂225mL低速搅动1～2min，使之匀质化，作为1∶10稀释液。再递增稀释成10^-2～10^-6的系列稀释液。吸取各稀释液1mL分别放于2个灭菌平皿内，每个平皿浇注约50℃的TSC（胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂）或SPS琼脂10～20mL，使稀释液和琼脂充分混匀。上述琼脂平板凝固后置于厌氧环境中于（36±1）℃培养24h。选取生长有30～300个黑色菌落的平板，计算黑色菌落数。

（2）确证试验

① 从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，（36±1）℃培养18～24h。

② 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。魏氏梭菌为革兰氏阳性粗短杆菌，有时可见芽胞。如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，（36±1）℃培养20～24h，挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，（36±1）℃培养18～24h，用于后续的确证试验。

③ 取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在（46±0.5）℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。魏氏梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。

④ 用接种环取FTG培养液穿刺接种缓冲动力——硝酸盐培养基，于（36±1）℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检查硝酸盐的存在。15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐。魏氏梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

⑤ 用接种环取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，（36±1）℃培养24h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右防止1h，检查明胶液化情况，如果培养基呈固态，于（36±1）℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。魏氏梭菌能发酵乳糖，液化明胶。

（3）家兔试验

取18～24h液体培养物0.5mL，注入家兔耳静脉内，10min后，将家兔处死，置37℃温箱5～8h后动物体内冲忙气体，腹部膨胀。剖检时，可见各脏器内有许多气泡，尤以肝脏为甚，故常称为“泡沫肝”或“海绵肝”，然后以肝脏进行涂片染色镜检和细菌分离培养。

5.3.10.9 食品生产综合控制

由于此菌的耐热性芽胞在人、畜粪便中常有发现，因此应注意肉品污染问题。另外温度与其代谢作用关系密切，故其加工制备的肉品及其他食品在贮藏和运销过程中要注意冷却措施。

5.3.11 志贺氏菌属（Shigellae） 

5.3.11.1 食品卫生学意义

志贺氏菌属是人类及灵长类动物细菌性痢疾（简称菌痢）最为常见的病原菌，俗称痢疾杆菌（dysentery bacterium）。本属包括痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、鲍氏志贺氏菌（S.boydii）、宋内志贺氏菌（S.sonnei），共4群44个血清型。4群均可引起痢疾，它们的主要致病特点是能侵袭结肠黏膜上皮细胞，引起自限性化脓性感染病灶。但各群志贺氏菌致病的严重性和病死率及流行地域有所不同，本菌只引起人的痢疾。我国主要以福氏和宋内志贺氏菌痢疾流行为常见，年统计病例为200万左右，发病率有逐年下降趋势，但仍居24种法定传染病的首位。引起人食物中毒或感染的主要是对环境抵抗力较强的宋内志贺氏菌。食物中毒的主要原因是食品加工、集体食堂、饮食行业的从业人员中患有痢疾或者是痢疾带菌者。在他们与食品接触过程中污染了食品，特别是液体或湿润状态的食品，在适宜的温度下细菌大量繁殖，临食前未充分加热就有可能引起食物中毒。据资料报道感染剂量约在20～10000个细菌，最低可达10个菌，属于致病较强的菌种。志贺氏菌食物中毒潜伏期一般为10～12h，最短者为6h，主要呈现突然剧烈的腹痛，呕吐、频繁的腹泻，初期部分或全部水样便，以后在便中混有血液和黏液。发热、体温可达40℃以上。

5.3.11.2 形态及染色特征

志贺氏菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，大小为（0.5～0.7）μm×（2.0～3.0）μm，为革兰氏阴性短小杆菌（图5-3-35）。长2.0～3.0μm，宽0. 5～0.7μm。无芽胞，无荚膜，有菌毛。长期以来人们认为志贺氏菌无鞭毛、无动力。最近重新分离志贺氏菌，电子显微镜证实有鞭毛、有动力。

5.3.11.3 生长要求及培养特性

志贺氏菌为需氧或兼性厌氧菌，对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，形成半透明光滑型菌落。最适生长温度为37℃，最适pH7.2～7.8。

① 普通琼脂 37℃培养18～24h，菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐，直径约2mm。宋内志贺菌菌落一般较大，不很透明，并常出现扁平粗糙的菌落。

② S.S琼脂 菌落形态和沙门氏菌相似，为无色半透明中等大或较小的菌落，边缘整齐，光滑、稍隆起。由于志贺氏菌不产生硫化氢，故在S.S琼脂培养基上的菌落中心不形成黑色。

③ 普通肉汤 呈均匀混浊生长，无菌膜。

5.3.11.4 生化特性

本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。除宋内氏菌个别菌株迟缓发酵乳糖（一般需3～4d）外，均不分解乳糖。甲基红试验阳性，V-P试验阴性，不分解尿素，不产生H₂S，对甘露醇的分解和产生靛基质的能力，因菌种而异。根据生化反应可进行初步分类，志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同可分为两组：不发酵甘露醇的为A群，即痢疾志贺氏菌1～10个血清型；发酵甘露醇的三个群，B群即福氏志贺氏菌1～6个型，C群即鲍氏志贺氏菌1～15个型，还有D群，即宋内志贺氏菌。再根据乳糖的分解与否及靛基质的产生，进一步分型。

生化试验：经KI、MIU于35℃培养18～24h后，生化试验符合表5-3-24，作氧化酶试验并与志贺氏多价、单价血清凝集，阳性者，初步定为志贺氏菌属（表5-3-25）。

福氏志贺氏菌6型生化特性与A或C群相似，并为甘露醇阴性。福氏志贺氏菌1、2、3、5型，鲍氏志贺氏菌3、14型有个别菌株为甘露醇阴性。

5.3.11.5 抗原和血清学特性

志贺氏菌属细菌有O和K两种抗原，缺少H抗原，其抗原结构主要由O抗原组成。O抗原是分类的依据，分群特异抗原和型特异抗原，根据生化反应和O抗原结构的差别，将志贺氏菌分为A、B、C和D四个群及40多个血清型（包括亚型）（表5-3-26）。

A群：即痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae），不分解甘露醇，有10个血清型，其中8型尚可分为3个亚型。

B群：即福氏志贺氏菌（S.flexneri），均发酵甘露醇，现有15个血清型（包括变型和亚型），各型间有交叉反应。我国以2a型为最常见血清型。

C群：即鲍氏志贺氏菌（S.boydii），生化反应近似于福氏志贺氏菌，有18个血清型，各型间无交叉反应。

D群：即宋内志贺氏菌（S.sonnei），抗原单一，只有一个血清型，发酵甘露醇。宋内志贺氏菌有Ⅰ相和Ⅱ相两个交叉变异相。Ⅰ相呈S型菌落，对小鼠有致病力，多从急性期感染病人标本中分离获得。Ⅱ相为R型菌落，对小鼠不致病，常从慢性患者或带菌者检出。Ⅰ相抗原受控于一个140Mu的大质粒，若质粒丢失，Ⅰ相抗原不能合成，菌则从有毒的Ⅰ相转变为无毒的Ⅱ相。

主要抗原包括：

① 型特异性抗原 型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。可用于鉴别各菌株的型别。

② 群特异性抗原 为光滑型菌的次要抗原，也是菌体抗原的一种，特异性较低，常在数种近似菌内出现。

③ 表面抗原（K）在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热，加热100℃1h即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。

5.3.11.6 抵抗力

志贺氏菌属对外界环境中的各种因素抵抗力不完全一样，以宋内志贺氏菌最强，福氏志贺氏菌次之，痢疾志贺氏菌最弱。对理化因素抵抗力较弱，对酸性环境也较敏感。在污染物品及瓜果、蔬菜上，志贺氏菌可存活10～20d。在适宜温度下可在水及食品中繁殖，引起水源型或食物型的暴发流行。一般加热50℃15min、60℃10min及阳光照射30min均能杀死志贺氏菌。对酸敏感，在粪便中有其他产酸菌即可使志贺氏菌在数小时内死亡。因此，粪检必须及时，否则不易检出。志贺氏菌对各种消毒剂敏感，如1%石碳酸、1%漂白粉或苯扎溴铵（新洁尔灭）15～30min均能有效杀死。由于磺胺及抗生素类药物的广泛应用，志贺氏菌的耐药株日益增多，即便是边远地区分离的志贺氏菌也常见4～8种抗药谱，耐药性主要由R质粒决定，严重影响临床疗效。

5.3.11.7 致病性

人类对志贺氏菌有较高的敏感性，一般只要10个菌以上就可以引起人的感染，儿童和成人易感染，特别是儿童，易引起侵袭性或感染性痢疾。大肠杆菌属和志贺氏杆菌属被认为是密切相关的，并且在有些情况下，它们被认为是非常相似的，因而被认为是同一种属。一般引起中毒的菌量在200～1000个/g。

（1）致病因子

① 侵袭力 志贺氏菌有菌毛，能黏附于回肠末端和结肠黏膜的上皮细胞。继而穿入上皮细胞内生长繁殖。一般在黏膜固有层内繁殖形成感染灶，引起炎症反应。入侵结肠黏膜上皮细胞是各群志贺氏菌的主要致病特性，细菌侵入血流罕见。各群志贺氏菌的侵袭相关基因都定位于1个140Mu大质粒上。而侵袭基因的完全表达则受质粒和染色体上多个基因的正、负调控。志贺氏菌穿透上皮细胞的能力由质粒编码的ipaB、ipaC和ipaD蛋白介导，病菌在细胞内外的播散则由质粒上的virG（icsA）基因控制。志贺氏菌只有侵入肠黏膜后才能致病。否则，即使菌量再大也不引起疾病。

② 内毒素 志贺氏菌所有菌株都有强烈的内毒素。内毒素作用于肠黏膜，使其通透性增高，进一步促进对内毒素的吸收，引起发热、神志障碍，甚至中毒性休克等一系列症状。内毒素破坏肠黏膜，可形成炎症、溃疡，呈现典型的脓血黏液便。内毒素尚能作用于肠壁植物神经系统，使肠功能发生紊乱，肠蠕动失调和痉挛，尤其是直肠括约肌痉挛最明显，因而出现腹痛、痢疾等症状。

③ 志贺毒素（Shiga toxin， STX）系外毒素，多由痢疾志贺氏菌1型和2型产生。ST能引起Vero细胞病变，故称Vero毒素（Vero toxin，VT）。STX的DNA序列、氨基酸序列与EHEC的VT-Ⅰ基本相同；与VT-Ⅱ则有60%的同源性，痢疾志贺氏菌产生的ST属VT-Ⅰ型。ST具有3种生物学活性：a.肠毒性，像大肠埃希氏菌VT毒素一样引起腹泻；b.细胞毒性，阻止小肠上皮细胞对糖和氨基酸的吸收；c.神经毒性，在痢疾志贺氏菌引起的重症感染者可作用于中枢神经系统，造成昏迷或脑膜炎。ST由位于染色体上的stxA和stxB基因编码；同EHEC产生的ST一样亦由一个A亚单位和5个B亚单位组成。B亚单位与宿主细胞糖脂（Gb3）结合，导入细胞内的A亚单位作用于60S核糖体亚单位的28S rRNA，阻止与氨酰tRNA的结合，致使蛋白质合成中断。

志贺氏菌侵入宿主后，机体内的IL-1、IL-6、TNF-α和INF-γ等细胞因子将增多。IL-1和TNF-α可提高ST受体在内皮细胞表面的表达，因而内皮细胞成为ST攻击的主要靶细胞。ST和内毒素有协同作用，两者在体外可加重对人血管内皮细胞的损伤。在志贺氏菌感染的溶血性尿毒综合征（HUS）等并发症中，ST和内毒素的持续存在的联合作用可能与之有关。对细胞操作的机制同Vero毒素。因此Ⅰ型痢疾志贺氏菌感染的临床症状较重，除血便、高烧外，常伴有血尿综合征和白血病样反应，病死率较高。新近发现福氏及宋内志贺氏菌也可产生少量类似的毒素。

（2）所致疾病

志贺氏菌引起细菌性痢疾。传染源是病人和带菌者（包括恢复期带菌者、慢性带菌者和健康带菌者），无动物宿主。主要通过粪便传播。志贺氏菌随饮食进入肠道，潜伏期一般为1～3d。痢疾志贺氏菌感染患者病情较严重，宋内志贺氏菌多引起轻型感染，福氏志贺氏菌感染易转变为慢性，病程迁延。我国主要的流行型为福氏和宋内志贺氏菌。志贺氏菌感染有急性和慢性两种类型，病程在两三个月以上者属慢性。急性细菌性痢疾常有发热、腹痛、里急后重等症状，并有脓血黏液便。若及时治疗，预后良好。如治疗不彻底，有10%～20%的病人可转为慢性。症状不典型者，易被误诊，影响治疗而成慢性或带菌者。急性感染中有一种中毒性痢疾，以小儿为多见。无明显的消化道症状，主要表现为全身中毒症状。因其内毒素致使微血管痉挛、缺血和缺氧，导致DIC、多器官功能衰竭、脑水肿，死亡率高，各型志贺氏菌都可能引起。志贺氏菌引起的感染性食物中毒有二型：①肠炎型：腹痛腹泻为主，水样便；②疾痢型：有典型的痢疾症状。

（3）免疫特性

志贺氏菌感染局限于肠黏膜层，一般不入血，故其抗感染免疫主要是消化道黏膜表面的分泌型IgA（SIgA）。病后免疫期短，也不巩固，除菌停留在肠壁局部外，其型别多也是原因之一。

5.3.11.8 细菌学检测

食品中志贺氏菌的检验，我国卫计委颁布了统一的标准检验方法（GB 4789.31—2013），其检验程序如图5-3-36所示。

① 样品 病人或带菌者粪便取材，挑取粪便的脓血或黏液部分。应迅速送检培养。若不能及时送检，将标本保存在30%甘油缓冲盐水或专门运送培养基内。中毒性痢疾患者可取肛拭。

② 分离培养与鉴定 标本接种于肠道杆菌选择培养基或鉴别培养基上，常用S.S培养基。37℃孵育18～24h，挑无色半透明可疑菌落，作生化反应和血清学试验，以确定其菌群（种）和菌型。

③ 毒力试验 测定志贺氏菌的侵袭力可用Senery试验。系将受试菌18～24h的固体培养物，以生理盐水制成9×10⁸CFU/mL悬液，接种于豚鼠眼结膜囊内，若发生角膜炎，则Senery试验为阳性，表明受试菌有侵袭力。志贺氏菌ST的测定，可用Hela细胞或Vero细胞，也可用PCR技术直接检测其产毒基因stxA、stxB。

④ 噬菌体裂解试验 按《GB 4789.31—2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验》（2014年6月1日实施）进行操作。

⑤ 快速诊断法

a.免疫染色法：将粪便标本与志贺氏菌抗血清混匀，在光镜下观察有无凝集现象。

b.免疫荧光菌球法：将标本接种于含有荧光素标记的志贺氏菌免疫血清液体培养基中，37℃孵育4～8h，发现带有荧光的菌球为阳性。若标本中含有相应型别的志贺氏菌存在，则生长繁殖后与荧光抗体凝集成小球，在荧光显微镜下易被检出。

c.协同凝集试验：是以志贺氏菌IgG与Cowan I葡萄球菌结合成为试剂，用来检测病人粪便中有无志贺氏菌可溶性抗原（用含有SPA的葡萄球菌标记志贺氏菌属抗体，测定病人粪便中或增菌培养液中细菌及其可溶性抗原）。

d.乳胶凝集试验：用志贺氏菌抗血清致敏乳胶，使与粪便中的志贺氏菌抗原起凝集反应。也可用志贺氏菌抗原致敏胶乳，来诊断便中有无志贺氏菌抗体。

e.分子生物学方法：PCR技术、基因探针检测140Mu的大质粒。

5.3.11.9 食品生产的综合控制

预防菌痢，除应对患者及时诊断、隔离和彻底治疗外，还应切断传染途径，包括加强粪便管理、水源管理及食品卫生监督等。一是食品从业人员每年进行一次健康检查是必要的，仍是一种保证食品安全卫生的手段之一。二是要对食品从业人员无病患者和病原携带者加强管理，对痢疾患者和带菌者在治愈后经三次大便培养阴性方可恢复工作。三是要加强健康教育，做好食品从业人员的卫生知识培训，注意卫生操作，加强食品卫生执法检查，强调消毒观念，食品加工佐料应新鲜制作，隔夜食品必须冷藏并重新煮沸后食用，确保食品的安全卫生。四是福氏志贺氏菌食物中毒不但夏秋季容易发生，冬季亦有可能发生，应引起重视。

鉴于志贺氏菌的免疫防御机制主要是分泌至肠黏膜表面的SIgA，而SIgA需由活菌作用于黏膜局部才能诱发。因此，接种死疫苗防御志贺氏菌感染的试验已经放弃，现致力于活疫苗的研究。例如链霉素依赖株（streptomycin dependent strain，Sd）活疫苗是一种变异株，环境中存在有链霉素时始能生长繁殖。将其制成活疫苗给志愿者口服后因正常人体内不存在链霉素，该Sd株不能生长繁殖；但也不立即死亡，尚可有一定程度的侵袭志愿者肠黏膜而激发局部免疫应答，产生SIgA。同时，血清中的IgM、IgG特异抗体也增多。Sd活疫苗的免疫保护具有特异性，目前已能产生多价志贺氏菌Sd活疫苗。多种杂交株活疫苗也在研究之中，如将志贺氏菌的大质粒导入另一弱毒或无毒菌中，形成二价减毒活疫苗。曾被选为研究对象的有宋内志贺氏菌与伤寒杆菌Ty2la的杂交疫苗等。

治疗志贺氏菌感染的药物颇多，但菌很易出现多重耐药菌株，同一菌株可对5～6种甚至更多药物耐药，给防治工作带来很大困难。

5.3.12 坂崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii） 

5.3.12.1 食品卫生学意义

坂崎肠杆菌为肠杆菌属的一个种，是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽胞杆菌，也是环境中的正常菌属。曾被称作黄色阴沟肠杆菌，直到1980年才被命名为“坂崎肠杆菌”。作为一种新型食源性条件致病菌，由于坂崎肠杆菌对所有年龄段的人群都有感染性，但主要是侵袭婴儿，所以引起了广泛关注。该菌被广泛地发现于家庭和医院的食品、水和环境中，而且从制造婴儿食品的环境中也发现了该菌。一般对成人影响不大，但对婴儿危害极大，尤其是早产儿、出生体重偏低（2500g以下），身体状况较差的新生儿，感染引发脑膜炎、脓血症和小肠结肠坏死，并且可能引起神经功能紊乱，造成严重的后遗症和死亡。婴儿感染率较低，为1/100000，低出生体重婴儿为8.7/10000。也有小部分成人感染骨髓炎和菌血症的报道，成人患病与婴儿相比显著轻微。由坂崎肠杆菌引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球范围内相继出现，在某种情况下由其引发疾病而致死的病例可高达40%～80%。1961年英国两位科学家Urmenyi 和Franklin首次报道2例由坂崎肠杆菌引起的脑膜炎病例，以后美国、希腊、荷兰、冰岛、加拿大、比利时等国家相继报道了新生儿坂崎肠杆菌感染事件。从调查病例的分析中，婴儿暖箱、孕妇产道、婴儿配方奶粉为可疑的感染源。2002年美国FDA从惠氏公司生产的婴儿配方奶粉中检出坂崎肠杆菌，2003年美国美赞臣公司自动召回一批检出极微量坂崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉后，配方奶粉中坂崎肠杆菌污染问题成为世界瞩目的焦点，引起世界多国相关部门的重视。目前科学家还不十分清楚坂崎肠杆菌的污染来源，但多数研究报告表明婴儿配方奶粉是目前发现的主要感染渠道。

最近的流行病学调查研究显示，该菌广泛存在于食品厂（奶粉、巧克力、谷物类食品、马铃薯和面食）和家庭、医院的食品、水和环境中，该菌在环境和食品中可能比原来想象的分布更广泛。进一步的流行病学研究显示，干燥的婴幼儿配方奶粉是致病的主要来源。坂崎肠杆菌引起的感染有散发，也有暴发。在许多案例中，这些暴发事件均是由被污染的婴幼儿配方奶粉引起，特别是容易发生在新生儿加护病房。坂崎肠杆菌也曾在其他食品中检出，但是只有婴儿配方奶粉与疾病的暴发相关，这可能与婴儿配方奶粉的生产方式有关，因为有的这类食品不经过高温加工，有可能残留坂崎肠杆菌。

Muytiens HL等曾对35个国家生产的141份婴儿配方奶粉进行检测，在20份试样中检出了坂崎肠杆菌，检出率为14%。M.chantal kandhai等从产自4个奶粉生产厂的68份试样中检出14份坂崎肠杆菌阳性样品，检出率为20.6%。一份来自Joint FAO/WHO workshop 关于婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌和其他细菌的未公开发表的调查报告，列出了婴儿配方奶粉中所用干燥成分中坂崎肠杆菌的污染情况。在脱脂奶粉、乳糖、香蕉粉/片、甘橙粉/片、卵磷脂、淀粉均污染有坂崎肠杆菌，除淀粉中坂崎肠杆菌污染率达2.88%，甘橙粉/片为1.64%、其他成分污染率较低，分别为0.95%～0.009%。

2004年中国安徽阜阳劣质婴儿配方奶粉事件引起了我国政府的高度重视。为了调查婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的污染状况，根据美国FDA和加拿大实验室的方法，建立了婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的分离鉴定技术，从87份阜阳劣质奶粉样品中检测到11份坂崎肠杆菌阳性样品，污染阳性率为12.6%，用API 20E和Qualicon BAX（R）系统鉴定出有11株坂崎肠杆菌阳性，这是国内首次从婴儿配方奶粉中分离到坂崎肠杆菌菌株。此前，在我国尚未见乳品中坂崎肠杆菌污染情况的调查报告，且对其传播途径及污染情况了解较少。为了解我国乳品中坂崎肠杆菌污染的程度，2004年，天津出入境检验检疫局天津实验室对产自12个省市、46个品牌的52种婴儿配方奶粉及其他类乳品共计91份样品进行了坂崎肠杆菌污染情况的调查。调查结果表明：仅有3份婴儿配方奶粉中检出坂崎肠杆菌，检出量为0.3～2.1CFU/100g，其余试样均未检出坂崎肠杆菌。但在多数试样中分离出了肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌等肠杆菌科细菌。检出肠杆菌科细菌的试样量占检测样品总数的58%。2012年任立松等从新疆进出口食品中分离出6株坂崎肠杆菌，并分析了致病因子。黄忠梅等2007年利用PCR方法对新疆进出口食品中的11大类、253批次进行初筛，用传统方法进行分离，最后用VITEK全自动生化分析仪进行鉴定。结果分别从饼干巧克力类、方便面类、谷物类、儿童食品类、干果类和其他类食品中检出阪崎肠杆菌，阳性率分别为：13.43%、8.16%、15.79%、75.00%、11.11%、11.11%。

5.3.12.2 形态及染色特征

坂崎肠杆菌作为肠杆菌科肠杆菌属的一种，在1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。随着对该菌认识的加深，根据坂崎肠杆菌与阴沟肠杆菌DNA-DNA杂交、生化反应、色素产生和抗生素敏感性的不同，研究人员对该菌的分类提出了质疑。1976年Steigerwalt等发现肠杆菌属菌株可分为与“黄色素存在或缺失”相关的两种不同的DNA杂交群。1977年Brenner等发现可根据D-山梨醇产酸和延迟产生脱氧核糖核酸酶区分产色素和不产色素的菌株。

1980年Farmer等建议对产黄色素的阴沟肠杆菌重新分类，在同一篇文献中Farmer等指出通过DNA-DNA杂交他们发现坂崎肠杆菌之间DNA一致性可达83%～89%，而坂崎肠杆菌与阴沟肠杆菌的DNA共有序列只有31%～49%。

坂崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽胞的棒状杆菌，有动力，属于肠杆菌属，肠杆菌科。大小只有（0.6～1.1）μm×（1.2～3.0）μm，不具荚膜，6～8条鞭毛（图5-3-37）。典型的坂崎肠杆菌的菌落形态包括VRBG琼脂：紫色的菌落周围伴随着紫色的胆汁酸沉淀光环；TSA琼脂：典型菌落出现黄色色素沉着（图5-3-38、图5-3-39）。

5.3.12.3 生长要求及培养特性

坂崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、血平板、麦康凯（MacConkey）琼脂，MAQ琼脂、伊红美蓝（eosin methylene blue，EMB）琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。所有的坂崎肠杆菌都能在胰蛋白酶大豆琼脂（trypticase soy agar，TSA）上36℃快速生长，24h后形成直径2～3mm的菌落；25℃生长24h后形成直径1～1.5mm的菌落，48h后形成直径2～3mm的菌落。Farmer等发现坂崎肠杆菌在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（Violet red bile glucose agar VRBG）平板上首次划线分离时，生长24h后可生成2种或2种以上的菌落形态，一种干燥或黏液样，周边呈放射状，用接种环触碰可发现菌落极富弹性；另一种是典型的光滑型菌落，极易被接种环移动。目前，尚不清楚这两种不同的菌落是否存在毒力和其他表型上的差别。Farmer等发现在TSA平板上培养24h后，所有的坂崎肠杆菌都产生大量的沉淀物，像是包含团状细胞和无定形组织。

坂崎肠杆菌能够在冷藏温度接触到婴幼儿奶粉的进料设备处生长。此外，还能够在乳汁、聚碳酸酯、硅和不锈钢上附着和生长。坂崎肠杆菌在室温下重新溶解的婴儿配方奶粉中生长得非常快，它的最适生长温度在37～44℃之间，某一种菌株显示出耐受性增加，在50～60℃时还能生长，在婴幼儿奶粉中生长最低温度为6℃。所有坂崎肠杆菌株在均能在45℃+/-0.5℃生长。

5.3.12.4 生化特性

Muytjens等研究了坂崎肠杆菌和相关菌株的酶反应特点。在对229株（其中129株是坂崎肠杆菌）细菌的研究中发现坂崎肠杆菌和其他肠杆菌之间存在两个主要的不同：坂崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶活性均为阳性，其他肠杆菌均为阴性包括产气肠杆菌（Enterbacter aerogenes）、阴沟肠杆菌（Enterbacter cloacae）、成团肠杆菌（Enterbacter agglomerans）；所有试验菌株中只有坂崎肠杆菌缺少磷酞胺酶。1985年Farmer等又检测了57株坂崎肠杆菌，其中53株α-葡萄糖苷酶活性均为阳性。由此认为，α-萄糖苷酶是用来快速区分坂崎肠杆菌和其他肠杆菌的可靠方法。1983年Aldova等评估了从捷克斯洛伐克分离的73株坂崎肠杆菌吐温80脂酶的活性，结果97.3%的菌株含有该酶。1984年Postupa和Aldova研究了从奶粉和婴儿配方奶粉中分离到的6株坂崎肠杆菌，发现所有的菌株在25℃和37℃培养7d后都产生吐温80脂酶。大量的研究结果表明，坂崎肠杆菌的生化反应与阴沟肠杆菌相似（表5-3-27，表5-3-28）。氧化酶阴性、D-山梨醇阴性、产生吐温80脂酶、细胞外DNAse阳性并形成黄色菌落。

5.3.12.5 抵抗力

坂崎肠杆菌生物体的热稳性类似于其他肠道细菌，标准巴斯德灭菌就应该杀灭。但是，和其他种类的肠道菌如大肠埃希氏菌、沙门氏菌相比，坂崎肠杆菌具有很强的抵抗渗透和烘干压力的能力，这很可能与细胞内大量的海藻糖酶有关。因为耐干燥，因此容易污染奶粉，证明坂崎肠杆菌能在婴儿配方奶粉中长期存活。微波加热是一种方便且快速的降低婴幼儿奶粉污染的有效方法。频率为2450 MHz、功率为600W的微波，根据奶型不同分别加热85～100s，平均温度为82～93℃，包括坂崎肠杆菌在内的大多数有关生长的生物体被杀死。

Breeuwer等研究发现坂崎肠杆菌并非具有特殊的耐热性，但能耐受一定程度的渗透压和干燥。另有研究结果证明，坂崎肠杆菌的耐热性不足以使该菌经标准的巴斯德消毒后幸存，产品的污染很可能发生在干燥和罐装阶段。人工污染坂崎肠杆菌（根据生产商推荐的冲调方法，配方粉稀释液坂崎肠杆菌浓度约为10⁶CFU/mL）的婴儿配方粉长期存放时细菌的生存状态。在将近一年半中配方奶粉室温放置在一个密闭的带盖瓶子中，定期从中取样做定量检测，在最初的5个月内，坂崎肠杆菌活菌数量下降了2.5logCFU/mL（从6.0logCFU/mL下降到3.5logCFU/mL），约下降0.5logCFU/mL。随后的1年内坂崎肠杆菌活菌数量又下降了0.5logCFU/mL，终浓度约3.0logCFU/mL。该结果证明坂崎肠杆菌能在婴儿配方奶粉中长期存活。

抗生素的治疗及其敏感性：一般说来，与肠杆菌属其他细菌相比，坂崎肠杆菌对常用的抗菌药更敏感。1985年对195株坂崎肠杆菌进行体外实验表明，坂崎肠杆菌对先锋霉素Ⅰ和新诺明之外的所有试验用药敏感，且该菌是唯一对氨比西林敏感的肠杆菌。1987年Arseni等报道了在同一NICU内11例婴儿坂崎肠杆菌感染事件，4名婴儿患有严重的脓血症，1例患有脑膜炎，尽管采用抗生素治疗，仍有4名患儿死亡。分离到的坂崎肠杆菌对氨基羟丁基卡那霉素A（即抗菌素BBK8）和托普霉素耐药，但对庆大霉素敏感。虽然坂崎肠杆菌的最佳抗生素治疗方法尚未确定，但在大多数早期报告的病例中都是应用氨比西林和庆大霉素联合疗法。1988年Willlis和Robinson把这种联合疗法称为“坂崎肠杆菌治疗的金标准”。1983年Muyjen等对坂崎肠杆菌引起的8例新生儿脑膜炎和脓血症病例进行分析，发现虽然所有菌株在体外试验中均对氨比西林、庆大霉素、氯霉素和卡那霉素敏感，但8例患儿只有2名经治疗后幸存。考虑到上述药物治疗效果不好，Muyjen等建议使用最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）较小且能渗入脑脊液的β-内酞胺类药物如头孢氢梭氧酞胺（拉氧头孢）作为治疗坂崎肠杆菌感染的首选药物，代替常见的“氨比西林和庆大霉素”联合疗法。研究显示，抗菌药monocaprylin可降低坂崎杆菌的活性。

早期文献报道的坂崎肠杆菌对各种抗生素都敏感，但自1987年以来，有关该菌耐药性的报道不断增加。2002年Dennison等从1名64岁患者伤口上分离到的坂崎肠杆菌药物敏感性与早期文献报道的相差甚远，该菌具有多重耐药性，包括氨比西林、庆大霉素和头孢霉素，但对环丙沙星（MIC<0.5μg/mL）、亚胺培南、妥布霉素和磺胺甲异恶唑敏感。2002年在Block等报道的感染事件中，系统性头孢霉素治疗对脑膜炎和菌血症有效，但对降低肠道细菌携带者的带菌情况没有可见的疗效，1名携带者在住院治疗18周后坂崎肠杆菌检测仍然呈阳性。所有临床患者、携带者和环境分离株的氨比西林MIC均低于4mg/L。临床分离株对除头孢奎琳之外的所有试验用药敏感，包括新一代青霉素和头孢霉素、碳青霉烯类、氟化奎林酮类、氨基糖甙类、四环素、磺胺甲异恶唑和氯霉素。所有分离菌株均为β-内酞胺酶阳性，该结果与头孢喹啉耐药相符合，但分离到的菌株对新一代头孢菌素敏感。针对坂崎肠杆菌耐药性的不断增强，近来相关文献建议采用碳青霉烯类或新一代头孢霉素和其他药物联合疗法。对于某些对氨基糖甙类和磺胺甲异恶唑仍然敏感的坂崎肠杆菌，可以把该类药物作为第二线治疗方案。当然，坂崎肠杆菌感染的合理治疗方案仍需根据临床诊断和细菌的药敏试验。

5.3.12.6 致病性

坂崎肠杆菌的污染及人群感染 坂崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生菌，该菌在自然界的污染来源尚不清楚，但在一定条件下可引起人和动物致病，因而被称为条件致病菌。坂崎肠杆菌引发的婴儿、新生儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎散发和暴发的病例在世界范围内多有报道，致死的病例可高达40%～80%。有关坂崎肠杆菌的毒力因子和致病性知之甚少。但有研究表明，并非所有坂崎肠杆菌均具有致病性。有些菌株产生类似肠毒素的化合物，通过组织培养，一些菌株产生细胞毒效果，通过口腔投给可引起幼鼠死亡。由坂崎肠杆菌和其他细菌引起的脑脓肿病，形态学上类似，且可能由类似的毒力机制引起。婴幼儿配方奶粉中含有极低水平的坂崎肠杆菌也存在危险，因为奶粉在贮存、冲调等过程中该菌生长很快，配方奶粉中坂崎肠杆菌达到3/100g时即可引起感染。婴幼儿感染坂崎肠杆菌风险高的原因是婴幼儿胃酸缺乏、高铁配方奶粉、奶粉的缓冲能力等。

坂崎肠杆菌具有很强的增殖能力 坂崎肠杆菌的传代时间在6℃、21℃、37℃分别是13.7h、1.7h、19～21min。对坂崎肠杆菌进行危险性评估发现，与本底相比，25℃放置6h该菌的相对危险性可增加30倍；25℃放置10h可增加30000倍。因此，即使婴儿配方粉中只有极微量的坂崎肠杆菌污染，在配方粉食用前的冲调期和储藏期该菌也可能会大量繁殖。2004年2月FAO/WHO在日内瓦召开的婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌专家研讨会上提出婴儿配方粉中微量的坂崎肠杆菌（<3CFU/100g）污染也能导致感染的发生。所以，对奶粉和婴儿配方奶粉的加工制作过程、家庭/医院的灭菌过程以及婴儿配方奶粉的储存和食用等关键控制点进行严格管理，是减少该类产品潜在危险性的重点。

（1）毒力因子

国际上对坂崎肠杆菌的毒力因子和致病性知之甚少。Pagotto等在2003年首次描述了某些坂崎肠杆菌可能产生一种毒力因子——类肠毒素样化合物，组织培养发现一些菌株可产生细胞毒效应。腹腔注射剂量达10⁸CFU/只时，18株试验株均可在3d内导致哺乳期小鼠死亡。经口灌胃，只有2株能引起哺乳期小鼠致死性损伤。SK92（肠毒素阳性）和MNW6（肠毒素阴性）腹腔注射致死剂量最小，而在最大口服剂量时仍不能引起小鼠的致死性损伤。由此看来，坂崎肠杆菌之间的毒性存在明显不同，而且，某些菌株可能是非致病性的，这在某种程度上可能与细菌在胃的酸性环境中存活能力有关。

（2）临床表现

坂崎肠杆菌感染的大多数病例都是婴儿，特别是早产儿、出生体重偏低等身体状况较差的新生儿感染，主要引起脑膜炎、脓血症、坏死性小肠结肠炎。坂崎肠杆菌引起的脑膜炎常引起脑梗死、脑脓肿靡肿形成和脑膜炎等并发症，并且可引起神经系统后遗症或迅速死亡。除了感染新生儿外，该菌偶尔还可引起成人局部感染和菌血症等。

新生儿脑膜炎 1961年英国的Fonklin等首次报道2例由坂崎肠杆菌（当时被描述为产黄色素阴沟肠杆菌）引起的脑膜炎病例。2名婴儿2d内先后死于无显著特征的感染性疾病，在脑组织中发现了病理变化。1965年丹麦的Joke等报道了1例新生儿病例，该患者在出生后4d内身体状况良好，4d后出现脑膜炎症状，并出现脑脓肿和脑积水等并发症。经Urlnenyi和Fonkhn会诊后，Joke判定分离到的细菌是一种“不常见”的肠杆菌，与Fonklin等从2例新生儿脑膜炎患儿脊髓液中分离到的细菌大致相同。1981年报道了美国印第安纳州1名由坂崎肠杆菌感染引起的严重的新生儿脑膜炎病例，在针对该患儿的病例研究中，研究人员确定了坂崎肠杆菌的致病性。被坂崎肠杆菌感染的患儿原本是健康的5周龄婴儿，入院时该患儿易发怒，但无发热症状，无尿道、胃肠道或中枢神经系统先天发育不良症状。患儿用氨比西林和庆大霉素治疗21d后出院，2个月后，患儿头围迅速增大，必须实行引流手术，患儿健康恢复缓慢并伴有严重的神经系统后遗症，由于坂崎肠杆菌是1980年重新命名的，所以在脑膜炎的诊断方面仍是一种不为人熟悉的细菌。1983年报道了该菌引起的新生儿小肠结肠炎和4例婴儿菌血症。1985年Naqvi等报道了1例出生21d的坂崎肠杆菌脑脓肿患儿，该患儿随后出现脑积水，经血管分流手术后存活下来。

① 新生儿菌血症 1979年Monr和Tift首次报道了坂崎肠杆菌感染但无脑膜炎症状的新生儿菌血症。感染发生在患儿出生后6d，用氨比西林治疗后疗效显著。1984年报道了1例早产儿由于坂崎肠杆菌感染引起的致命性菌血症。该事件发生的1个月内，同一新生儿护理室的11名其他新生儿也相继出现了严重的脓血症，其中4人死亡。1990年Noriega等从出生6个月院内感染菌血症的婴儿体内分离到坂崎肠杆菌和肠膜明串珠菌。

② 新生儿小肠结肠炎 2001年Acke等报道了比利时一家医院Mcu中坂崎肠杆菌引起的坏死性小肠结肠炎暴发事件，1998年6～7个月共12例新生儿患坏死性小肠结肠炎，其中一对孪生兄弟因病情严重不治而亡。

③ 成年人感染 大多数文献报道的坂崎肠杆菌感染都是新生儿。然而，也有成年人坂崎肠杆菌感染的报道。1982年Inene等报道了由坂崎肠杆菌感染引起的1名76岁老人尿脓血症。1985年从1名糖尿病患者足部溃疡部位分离到3种细菌，其中包含坂崎肠杆菌。3例成人患者分别用氨曲南、氨比西林和庆大霉素、头孢曲松治疗后康复。2001年Lai等报道了马萨诸塞州州立大学医学中心1995～1996年4例成人坂崎肠杆菌感染事件。在这4名成人患者中，有2名患肺炎，2名患菌血症。尽管使用抗生素治疗仍有3名患者死亡。2002年从1名64岁的外周血管病患者的伤口上分离到坂崎肠杆菌。2002年Ollgodi等报道了坂崎肠杆菌引起匈牙利1名26岁女患者阴道感染。

5.3.12.7 细菌学检测

参考国家标准GB 4789.40—2010进行检验（图5-3-40）。GB 4789.40—2010中坂崎肠杆菌的检测方法有2种：①阪崎肠杆的检测；②阪崎肠杆菌的计数。

也可以根据美国FDA公布的最新的坂崎肠杆菌检验方法进行检验。FDA的坂崎肠杆菌的检验程序是符合它作为肠杆菌属的一个种类这一属性的。该方法具有快速、特异、灵敏的特点，既经典又结合了现代API生化鉴定系统的优势，值得普及和推广。

（1）培养基和试剂

①胰化大豆蛋白琼脂（TSA）；②结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBG）；③肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤）；④氧化酶试剂（N，N，N'，N'-四甲基对苯二胺·HCl），该试剂最好现用现配，试剂装在黑色瓶子放在冰箱里，可以保存7d。

（2）坂崎肠杆菌的鉴定

整个试验是基于“三管”增菌法，因此产品中数量极少的微生物可以被检测和定量，整个试验至少需要333g样品。

① 按“三管法”分别无菌称取1g、10g、100g婴儿配方奶粉，依次加至125mL、250mL、2L大小的三角烧瓶中，分别加入9份无菌蒸馏水（1∶10稀释比），预热至45℃，用手缓缓地摇动至充分溶解。36℃孵育过夜。

② 分别移取以上混合液10mL转种至90mL无菌EE肉汤的160mL稀释瓶中，36℃孵育过夜。

③ 充分混合每个瓶子中的溶液，可采用以下A或B的方法进行分离培养：

a.直接涂布法：每一个增菌培养物接种两个VRBG平板的表面，每一个VRBG平板各加0.1mL，用无菌玻璃棒涂布（如果估计婴儿配方奶粉有很高的坂崎肠杆菌数量，则增菌培养物须用无菌的EE肉汤稀释至10^-4～10^-6后涂布）。

b.直接划线法：每一增菌培养物用3mm的接种环（10μL）分别划2个VRBG平板。至少将平板分成3块，以便分离出单个菌落（划线平板包括备份，以免在划线平板上生长太而不包括分离的菌落）。

④ 将上述平板放置36℃过夜后，观察平板上的坂崎肠杆菌的典型菌落形态。

⑤ 挑取5个坂崎肠杆菌可疑菌落，分别划线接种至5个TSA琼脂平板，25℃培养48～72h。

⑥ 在TSA琼脂平板上挑取黄色无光泽的菌落按API20E生化鉴定操作说明进行确证。阳性结果还需做氧化酶试验。

⑦ 根据每一稀释度出现的阳性确证结果数来估计坂崎肠杆菌MPN值。

（3）调查检测方法（参照美国FDA推荐的MPN法）

① 取样 液体样品：反转样品包装数次，以使样品均匀，但应避免形成泡沫。以无菌操作打开包装取样。

粉状样品：反转样品包装数次，以使样品均匀。以无菌操作打开包装取样。若样品装得过满，则应将其置入较大的容器中混匀。

固体样品：以无菌操作，随机抽取有代表性的样品，充分剪碎并搅拌均匀后取样。

② 制样及增菌培养

a.液体样品：以无菌操作，一式三份量取混匀后的试样100mL、10mL、1mL，分别接种于装有900mL、90mL、9mL并预热至45℃灭菌蒸馏水的三角瓶中。充分振摇使其溶解。36℃过夜培养后，分别移取上述培养液10mL转种至装有90mL EE肉汤的三角瓶中，36℃过夜培养。

b.粉状/固体样品：以无菌操作，一式三份称取试样100g、10g、1g，分别接种于装有900mL、90mL、9mL并预热至45℃灭菌蒸馏水的三角瓶中，充分振摇使其溶解。36℃过夜培养后，分别移取上述培养液10mL转种至装有90mL EE肉汤的三角瓶中，36℃过夜培养。

③ 分离及鉴别 用直径3mm接种环取各培养物一环，分别划线于结晶紫-中性红-胆盐-葡萄糖琼脂（VRBGA）平板。36℃培养24h，自每个平板上至少挑取5个典型或可疑菌落，分别接种于TSA琼脂平板，于25℃培养48～72h，挑取产黄色素的菌落，用API20E试条及氧化酶试验进行生化试验及确认，根据MPN表由所确认的阳性瓶数估算每100g/mL试样中坂崎肠杆菌的最近似值。

国外也有研究报道，利用real-time PCR检测方法，设计一套引物和探针，在纯的培养物和婴儿配方中，无需富集即可检测到100CFU/mL，检测的特异性足以区别所有其他肠道菌和非肠道菌。可节省到5d时间，去除了在选择或诊断琼脂上生物化学证实的步骤，达到迅速筛检配方奶粉中坂崎肠杆菌的目的。

中国检验检疫科学研究院与天津检验检疫局共同牵头，已建立了坂崎肠杆菌改进的传统检测方法（经典方法）、普通PCR方法和荧光PCR方法等（快速筛选方法），并分别进行了初步验证实验，其中改进的传统方法与美国FDA方法相比检测结果一致，但效率大大提高，时间缩短三分之一至二分之一。从而解决了我国检测婴幼儿配方奶粉中坂崎肠杆菌无标准方法可依，企业也缺乏有效控制该菌手段的问题。天津出入境检验检疫局承担该检测方法中第一、二部分奶粉中坂崎肠杆菌的分离与计数方法和奶粉中坂崎肠杆菌的PCR检测法的研究及标准起草工作。由于此前坂崎肠杆菌检测国内还没有相应的方法标准，此次建立的标准操作性强、特异性好，检测方法对美国FDA的方法进行了确认和改进，并增加了PCR和荧光PCR两种快速筛选方法，填补了国内空白，达到了国际水平。

5.3.12.8 食品生产的综合控制

1996年第29次CCFH大会明确了关于食品中微生物的安全控制不应停留在终产品的检测上，应该控制食品的生产、加工、贮存、制备、销售等全过程，强调运用GMP和HACCP等科学管理体系，以保证出厂产品的安全性。除了对婴儿配方食品的营养成分进一步科学规范和严格监督外，也不应忽视婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的污染及其健康危害。

婴儿配方奶粉不是商业无菌的，尽管在加工过程中有加热处理，但未彻底灭菌，成品中仍含有一部分细菌，坂崎肠杆菌阳性检出率占14%，因此专家建议最好能采用商业无菌的液态奶。通常该菌在婴儿配方奶粉中的数量很少，并不能引起疾病。如果生产设备污染了该菌，或不正确的处理和贮藏方法都可能导致它的生长。然而，生产环境的污染、添加原料的质量，以及目前的生产规范尚不能保证生产无菌产品，因此可能含有病原菌。

1961～2003年发生的48起婴儿坂崎肠杆菌感染事件中，有25起发生于新生儿感染。即使低浓度的污染，坂崎肠杆菌也可在奶粉的冲调、放置过程中大量繁殖而成为感染的危险因素。以下3种主要途径可以导致婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的污染：①通过生产婴儿配方奶粉的原料；②在巴氏杀菌后，配方粉污染或其他添加剂干粉带入；③婴儿食用前被污染。为了控制婴儿配方食品中坂崎肠杆菌的危险性，FAO和WHO专家建议：应对不能进行母乳喂养的婴幼儿，特别是高危人群提出警示，配方乳粉并不是灭菌产品，可能被病原污染并引起疾病。降低危险性的措施来源于社会的各相关层面，包括管理者国际法典委员会在修订操作规范时，应侧重于强调对婴儿配方奶粉中微生物危险性的控制，必要时制定婴儿配方奶粉中适宜的坂崎肠杆菌微生物标准，应特别关注某些发展中国家的需求，建立有效的控制措施，把代乳品的危险性降到最低。

生产者应制定加工、使用和操作婴儿配方食品的导则，将危险性降到最低，为高危人群生产较大比例的商业无菌配方替代产品，在生产环境和配方奶粉中降低坂崎肠杆菌的浓度和流行的危险性。制定有效的环境监测计划，并把肠杆菌科而不是大肠菌群作为工业生产线的卫生指标菌。科技工作者应运用国际确认的坂崎肠杆菌及相关病原菌的检测和分子分型方法，对坂崎肠杆菌及相关病原菌的来源、传播途径等进行调查，建立实验室监测网络。加强相关基础研究，包括生态学、分类学、菌株毒力，以及降低婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌污染水平的方法。消费者应该用商业无菌液体或开水冲调配方食品，喂食婴儿剩余的液体调配食品应放置冰箱保存，并在食用前再加热。

婴儿配方奶粉制作过程中可能导致坂崎肠杆菌污染主要有2个环节：①通过配方制造过程中未进行热处理的成分污染——干法和混合法；②从干燥步骤加工环境中污染，也就是热处理后，在干燥或包装间被污染——干法、湿法、混合法。国外对相关配方产品进行的生产原料调查资料表明，在配方奶粉生产中使用的配方原料中，淀粉被致病性微生物污染的危险性更高。要保证配方奶粉的安全性，一定要按严格的标准选择原料供应商，批批检验，以确保各成分的安全性。建立国家标准，也是对外国奶粉进入中国市场的一种技术壁垒。

5.3.13 链球菌

5.3.13.1 食品卫生学意义

链球菌（Streptococcus）是化脓性球菌中的另一大类常见的细菌，广泛分布于自然界，水、乳类、尘埃、人及动物粪便、肠道及其皮肤病灶中和健康人鼻咽部均有存在。能使多种动物感染发病，尤其是猪。美、英、法、日、俄罗斯、丹麦、荷兰、爱尔兰、安哥拉、加拿大等二十多个国家先后报道过猪链球菌病，我国也不例外。猪链球菌病作为人与猪之间的人畜共患传染病，已有人类感染链球菌的多次报道。链球菌引起人类的疾病主要有各种化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎和风湿热、肾小球肾炎等超敏反应性疾病，人与猪的临床病理基本类似。对人类来说猪链球菌是机会致病菌。

本菌具有一种群特异性抗原，又称“C”抗原，根据兰氏（Lancefield）用酸浸出这种抗原，与特异抗血清做沉淀试验，将链球菌分成A至U等19个血清群（缺I、J群）。每个群又分为若干个型或亚型。现将其中较为重要的血清群致病概况介绍如下：

A群：只对人类致病，如猩红热、扁桃体炎、丹毒以及各种炎症和败血症。对动物致病性不强，但在公共卫生上意义重大。

B群：致牛乳房炎，对人无致病性，如无乳链球菌等。

C群：主要对各种动物致病，共有二十多型。其中一部分对人有致病性。

D群：寄生于人、畜及禽类肠道中，属肠球菌的一部分，一般不致病，偶尔可引起小猪心内膜炎、关节炎、羔羊心内膜炎、肺炎。一般与食物中毒有关，如粪链球菌、屎链球菌等。

E（R）群：寄生于牛猪阴道，对组织的侵入能力不强，又称猪链球菌，可引起猪颈部淋巴结脓肿、化脓性支气管炎、脑膜炎及一部分乳房炎等。近来，发现猪链球菌对人也有很强的致病性，并可引起人的死亡。

由于在自然界分布广泛，是食物污染的重要原因。许多食物媒介引起链球菌猩红热，多为A群链球菌引起；α溶血性链球菌经肉、乳等食品引起食物中毒；猪链球菌引起人的猪链球菌病，又是近年来引起关注的重要人畜共患病。因此，链球菌在公共卫生上具有十分重要的意义。

海豚链球菌（Streptococcus iniae）也是链球菌属成员，是鱼类和人共感染病原菌，具有人兽共患性质。分布广泛，包括北美、中东和亚太地区。偶尔通过鱼类等水产品使人感染，也是食源性感染菌。

5.3.13.2 形态及染色特征

链球菌为不产生芽胞的链状革兰氏阳性细菌，直径为0.5～2.0μm，球形或卵圆形（球杆状），细胞呈对或呈链状排列。链的长短与菌的种类与生长环境有关，短者由4～5个菌体组成，长者可达20～30个甚至上百个。致病性链球菌链一般较长，非致病性或毒力弱的菌株链较短，在液体培养中易呈长链，在固体培养基上常呈短链，易与葡萄球菌混淆。革兰氏阳性，衰退型菌常转为G^-（即革兰氏阴性），化脓性链球菌不形成芽胞，不能运动，无鞭毛，但D群和X群中某些菌株有鞭毛，有菌毛。有的菌种在幼龄期（2～4h）形成透明质酸的荚膜、可抵抗吞噬，当培养时间延长，荚膜即逐渐消失（图5-3-41）。

链球菌用普通苯胺染料易于着染，自病灶分离的链球菌为革兰氏阳性，但若长时间培养，或被吞噬细胞吞噬后，革兰氏染色常可为阴性。

5.3.13.3 生长要求及培养特性

本菌为化能异养，生长要求复杂。为需氧或兼性厌氧菌，部分为厌氧菌。大多为兼性厌氧，少数为厌氧和微厌氧链球菌。如消化链球菌为厌氧链球菌，营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在补充有血液、血清、葡萄糖等成分的培养基上生长良好。多数致病菌株的营养要求较高，在普通培养基上生长不良，必须有血液等方能生长好。生长温度为25～45℃，最适生长温度为37℃，D群的大多数菌株，虽低至10℃，高达45℃仍能生长，N群株最适生长温度为30℃。最适pH7.4～7.6。在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状沉淀。在血琼脂平板上，形成灰白色、表面光滑、边缘整齐、直径0.5～0.75mm的细小菌落，不同菌株溶血不一。

链球菌在不同培养基上生长的特点：

血琼脂平板：37℃经18～24h，形成灰白色、半透明或不透明，表面光滑，有乳白色光泽，直径0.5～0.75mm的细小菌落。在血琼脂平板上，不同菌株菌落周围可有不同的溶血现象，有的完全溶血，在菌落周围形成透明溶血环；有的不完全溶血，形成草绿色溶血环；有的不发生溶血，无溶血环可见。

血清肉汤：一般呈颗粒状生长，大多沉于管底。生长状况与链的长短有关，溶血性链球菌形成的链一般较长，呈典型的絮状或颗粒状生长，或黏附于管壁上。不溶血菌株链较短，或呈双球菌状，呈均匀混浊。

马铃薯培养基：非致病性链球菌发育良好，而致病性链球菌则生长不良。

5.3.13.4 生化反应

能分解葡萄糖，产酸不产气。对乳糖、甘露醇、水杨苷、蔷薇醇和蕈糖的分解随不同菌株而异，一般不分解乳糖和菊糖，不被胆汁溶解，据此可用来鉴定甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌。产生触酶，与葡萄球菌不同。多数A群链球菌能产生淀粉酶，不仅分解淀粉，也可以水解肝糖和淀粉黏胶质。链球菌可在6.5%氯化钠葡萄糖肉汤，40%胆汁肉汤、pH 9.6葡萄糖肉汤和0.1%美兰牛乳培养基中生长，能在10℃和45℃下生长，可作为肠链球菌与其他链球菌的鉴别试验。

（1）按溶血能力分类

根据链球菌在血液琼脂平板上菌落周围的溶血现象，分为以下3类。

① α型溶血链球菌 在菌落周围形成不透明的草绿色溶血环，故又名草绿色链球菌。

② β型溶血链球菌 又称化脓性链球菌，在菌落周围形成完全透明的溶血环。

③ γ型链球菌 无溶血现象，如肠球菌。

（2）按抗原组成成分主要有三种

① 多糖抗原（C抗原或群抗原）具有族特异性，是Lancefield血清学分类（A-T族）的依据，是细菌壁的组成成分。对人致病的90%属于A族，其次为B族，其他族少见。兰氏（Lancefield）用温热的稀盐酸浸出这种抗原，与特异抗血清作沉淀反应，将链球菌分成若干群，A至U，19个群（中间缺I，J）。α型链球菌的致病力一般较弱，多引起局部化脓性炎症。R群α型猪链球菌可感染人和在人畜共患病及职业病方面具有重要意义。对人和动物有致病作用的各种血清型链球菌中较为重要的是溶血性链球菌、绿色链球菌、猪链球菌、屎链球菌和粪链球菌，还有海豚链球菌。

② 表面蛋白抗原（或型特异性抗原）除M蛋白质抗原外，还有T、R和S和表面蛋白抗原。具有型特异性，是链球菌细胞壁的蛋白质抗原，位于C抗原外层，同族链球菌可根据表面抗原不同进行分型，如A族链球菌可据此分为60多型。M蛋白质是A族链球菌一种重要毒力因子，具有抗吞噬作用。M蛋白与心肌肌浆蛋白有共同抗原表位，故与风湿性心肌炎发生有关。

③ 核蛋白抗原（P抗原）无种、属、群、型特异性，各种链球菌均相同，与葡萄球菌和肺炎球菌的核蛋白有交叉。

（3）按抗原结构分类

根据族特异性C抗原不同，将链球菌分为A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T等18个族。对人致病的大多属于A族。A族又称为化脓性链球菌（Pyogenic streptococcus）。

（4）根据对氧需求分类又可分为需氧、兼性厌氧和厌氧三大类链球菌。

（5）致病血清群

链球菌属中对人和动物有致病作用的血清群主要有A、B、C、D、E和R等六群。

① A群 主要对人类致病，如猩红热、扁桃体炎及各种炎症和败血症。其中的化脓性链球菌最为典型，在自然界分布广，也常存在于人的皮肤或黏膜表面、口腔、呼吸道及各种病灶中，可引起人类多种疾病。

② B群 过去认为对人无致病性，但是，B.A.Maxapob认为对人有致病作用的各种血清型的链球菌中便有B群。

③ C群 有二十多个型，部分对人致病，但比较轻，不甚重要。

④ D群 引起食物中毒的最常见的是粪链球菌和屎链球菌。美国长岛8个鸭饲养场小北京鸭感染粪链球菌，李国江等报道了鸽粪链球菌病，说明粪链球菌分布较广，值得重视。

⑤ E群 主要是猪链球菌，心内膜炎链球菌是E群的，它可致亚急性心内膜炎。猪链球菌感染的资料多来源于荷兰、丹麦等欧洲国家，被感染者所表现出的临床特征与淋巴结炎、脑膜脑炎、关节炎、化脓性咽炎和急性败血症相似，我们国家2005年暴发猪链球菌病，导致40多人死亡。

⑥ R群 该群链球菌感染人类的报道极少。

链球菌中多种血清群（A、B、C、D、E等群）对人均有致病作用，尤其是A群和D群的致病性最明显。另外，肺炎链球菌为人类的大叶性肺炎、脑膜脑炎等疾患的病原体，但血清群未定。

5.3.13.5 抵抗力

链球菌的抵抗力不强。对热比较敏感，55℃可杀死大部分链球菌，但少数肠链球菌、粪链球菌在60℃30min方可杀死，煮沸立即致死。一般消毒剂均有效，对干燥有一定的抵抗力，在干燥尘埃中可存活数日，对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素等均敏感，耐药性低。在脓汁中和渗出物中可存活数周。

5.3.13.6 致病性

（1）毒素和酶

① 溶血素 有溶解红细胞、杀白细胞以及毒害心脏的作用。溶血素分O及S两种。

a.溶血素O：A、C、G群的多数菌株能产生此种毒素。溶血素O是含有—SH的蛋白质，对氧敏感，遇氧被氧化成—SS—，暂时失去溶血能力。若加入0.5%亚硫酸钠或半胱氨酸，又能重新恢复溶血作用。溶血素O有较强的心脏毒，对白细胞有细胞毒作用，破坏红细胞和血小板。溶血素O具有抗原性，各群链球菌的溶血素O的抗原性都相同，感染链球菌后可检出抗溶血素O抗体。

b.溶血素S：对氧稳定，但对热和酸敏感，不易保存，抗原性低。链球菌在血液琼脂上的溶血现象是S溶血素的作用结果。溶血素S较溶血素O的作用缓慢，也能破坏白细胞和血小板，对组织培养细胞有变性作用。给动物静脉注射此种溶血素可迅速致死，剖检可见血管内溶血及肾小管坏死等病变。

② 红疹毒素 主要是A群链球菌产生的，C、G群的某些菌株也可产生。此毒素为蛋白质，分子量约为2.7kDa，有抗原性。小剂量注入人或家兔的皮内，可使局部出现红疹；大剂量时可致全身红疹。据报道，只有A、C、G族致病性链球菌能产生红疹毒素，使易感者出现发热、头痛、皮肤红疹、恶心呕吐，但由B族乙型链球菌引起的食物中毒事件中，部分中毒者也出现了皮肤发痒、红疹等过敏症状，推测部分B族致病性链球菌变异株同样具有温和噬菌体，能产生红疹毒素。

③ 链激酶 又称为溶纤维蛋白酶，耐热，100℃加热50min仍保持活性，能使血浆蛋白溶酶原变为血浆蛋白酶，溶解血块或阻止血浆凝固，以利于细菌在组织中扩散。

④ 链道酶 又称为脱氧核糖酶，有A、B、C、D四个血清型，具有抗原性。能分解黏液性的DNA，以利于细菌在组织中的扩散。

⑤ 透明质酸酶 亦称扩散因子，有抗原性。此酶可溶解结缔组织间隙的黏合质——透明质酸，增加组织间隙的通透性，便于细菌和毒素向周围组织扩散，以提高细菌的侵袭力。

⑥ 脂磷壁酸（LTA）与细菌黏附于宿主细胞表面有关，大多数LAT位于细胞膜和肽聚糖之间，通过肽聚糖孔伸展至细菌细胞表面，人类口腔黏膜和皮肤上皮细胞、血细胞等细胞膜上均有LAT的结合位点。

（2）致病性

目前临床上报道的链球菌病大多是β溶血型。链球菌存在于人和动物的皮肤、呼吸道、消化道及泌尿生殖道的黏膜上，能够引起皮肤、呼吸道及软组织感染，如肺炎、菌血症、心内膜炎、脑膜炎、泌尿生殖道炎症及关节炎等疾病，是最重要的细菌性传染病之一。传染源为病人和通过直接接触、食入、飞沫或经皮肤、黏膜的伤口侵入机体。化脓性炎症于皮肤或皮下组织可引起局部痈、脓肿等。由于产生链激酶、链道酶和透明质酸酶等使脓汁稀薄，有利于细菌在组织中扩散，易引起蜂窝组织炎，细菌沿淋巴管和血管扩散易引起丹毒、淋巴管炎及其他系统感染，主要有扁桃体炎和咽炎。

猩红热：由产生致热外毒素的化脓性链球菌所致。细菌经咽喉黏膜侵入机体，增殖并产生毒素引起高热、全身红疹等症，临床特征为发热、咽峡炎、全身弥漫性皮疹和疹退后的明显脱屑，病后获得较强的免疫力。

链球菌感染后超敏反应：①急性肾小球炎：在扁桃体炎和咽炎感染后均可发生，多见于儿童或青少年，主要由化脓性链球菌的M12型菌株引起。发病机理是由于M蛋白和机体所产生相应抗体两者结合形成免疫复合物，沉积于肾小球基底膜引发Ⅲ型超敏反应导致基底膜损伤；其次是由于链球菌的胞浆膜抗原与肾小球基底膜可溶性成分有共同抗原，机体对链球菌胞浆膜抗原所产生的抗体，便可与肾小球基底膜可溶性成分发生反应，机体对链球菌胞浆膜抗原所产生的抗体引起肾小球基底膜Ⅱ型超敏反应，引起损伤；②风湿热。主要在咽炎后有可能发生，由化脓性链球菌多种型别引起。临床表现以关节炎、心肌炎为主，发病机理不是链球菌直接侵袭所致。因为病人的病变部位和血液中并无链球菌，风湿不是发生在链球菌感染的同时而是发生在感染后的1～4周。有人认为是链球菌细胞壁上M蛋白与其抗体形成免疫复合体，沉积于心瓣膜和关节滑膜上而引起的Ⅲ型超敏反应，造成心肌和关节组织损伤可能是由于链球菌细胞壁多糖抗原与心瓣膜等组织的糖蛋白有共同抗原，引起Ⅱ型超敏反应，造成心脏损伤。

海豚链球菌通过水产品或鱼类感染人，包括罗非鱼等很多鱼类感染，感染后海豚呈皮下脓肿，罗非鱼等呈脑膜炎、全眼球炎，高发病率和死亡率（5%～50%）。人因伤口接触鱼类而感染，常见于手蜂窝织炎、脑脓肿、菌血症、关节炎等。

（3）免疫特性

链球菌的抗原构造比较复杂，感染后可以产生多种抗体，但只有抗M蛋白抗体具有保护作用。然而M蛋白有许多型，且各型之间又不交叉，因此感染某一型细菌所形成的免疫，不能对其他型感染产生保护作用，一般说来免疫效果都不够理想。但我国目前试制的猪羊链球菌疫苗，免疫效果良好，保护率达80%以上。

5.3.13.7 细菌学检测

根据链球菌所致疾病不同，可采取脓汁、咽拭、血液和食物等标本送检。D群链球菌分类及鉴定程序见图5-3-42。

① 直接涂片镜检 脓汁等可直接涂片，革兰氏染色镜检。发现革兰氏阳性呈链状排列的典型链球菌时，就可以初步诊断。如脓汁中有链球菌而培养阴性时，则应怀疑有厌氧链球菌存在。

② 分离培养 取脓汁或咽拭子直接在血液琼脂平板上分离培养；血液标本则必须先用葡萄糖肉汤增菌后再分离培养。食物样品的增菌培养：称取检样加入灭菌生理盐水制成混悬液进行增菌培养。一般鉴定主要依据形态、染色、菌落特征、溶血情况等进行。如需要可用沉淀反应做血清学分族和分型。脓汁或棉拭直接划线接种在血琼脂平板上，孵育后观察有无链球菌菌落。根据溶血性不同可区分为甲型、乙型或丙型链球菌。有β溶血的菌落，应与葡萄球菌区别；α溶血的菌落，要和肺炎球菌鉴别。疑有败血症的血标本，应先在葡萄糖肉汤中增菌后再在血平板上分离鉴定。心内膜炎病例，培养草绿色链球菌宜孵育3个星期以上。

③ 血清学试验 抗链球菌溶血素O试验（Anti-streptolysin O test，ASO test）简称抗O试验。常用于风湿热的辅助诊断。患者血清中的抗O大多在250单位左右，最高者一般超过400单位。Dick试验猩红热病人早期阳性，病后转阴。

④ 快速检查 已有快速检查咽拭子中化脓性链球菌抗原试验的试剂盒，即用酶或化学方法提取咽拭子中抗原，经ELISA检查4h就可得出结果。

4.3.13.8 食品生产中的综合控制

防控措施是加强对食品保存环境的消毒灭菌及对食品从业人员的健康体检工作，加强卫生防病知识的宣传，提高人们对食物中毒的认识和预防，确保人民身体健康。由于链球菌分布广泛，应加强对各类食品的卫生监督，尤其是近年来猪链球菌对人的危害，在接触猪和食用猪肉时注意防范。海豚链球菌的预防主要是避免有伤口时期接触鱼类。

链球菌感染的防治原则与葡萄球菌相同。食物中毒以外的链球菌主要通过飞沫传染，应对病人和带菌者及时治疗，以减少传染源。空气、器械、敷料等注意消毒。对急性咽喉炎和扁桃体炎患者，尤其是儿童，须治疗彻底，防止变态反应疾病的发生。所有溶血性A链球菌对磺胺、青霉素及红霉素等都敏感。其他族细菌对抗生素的敏感不同，临床应用最好作药物敏感试验。

5.3.14 猪链球菌

5.3.14.1 食品卫生学意义

猪链球菌（Streptococcus suis）（图5-3-43）是猪的一种重要人畜共患病病原菌，猪链球菌病是由C、D、E、L及R群链球菌引起的猪的多种疾病的总称。自然感染的部位是上呼吸道、消化道和伤口。表现为急性出血性败血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等，属国家规定的二类动物疫病，养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有本病发生。链球菌分布广泛，常存在于健康动物和人体内，猪链球菌是广泛存在于自然界的一种细菌，一般在猪的体表、呼吸道、消化道等处都可发现。而在以往猪的疾病检测中，30%的猪链球菌都是2型，据报道这个检出率在国外更高，能达到70%以上。猪链球菌灭活苗虽然有效但免疫效果或预防效果还有待深入探讨。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。20世纪80年代初加拿大猪链球菌引起的疾病开始增加，那时就检出9种荚膜血清型，其中2型是最常见的。

猪链球菌截止到目前已发现的荚膜型已超过30种。我国于1958年在广东中山首次在国内发现并鉴定出了猪链球菌，1970～1979年在韶关等地区大范围流行，造成1500～30000g重的小猪发高热死亡，1986～1987年在广东证实2型猪链球菌在我国的存在。地理分布主要在北欧和南亚一些养殖和食用猪肉的国家和地区。猪链球菌可致2～6周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等。病猪和带菌猪是本病的重要传染源，病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节内均可检出病原体。未经无害化处理的病死猪肉、内脏及废弃物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要传播途径。本病一年四季均可发生，但以4～10月份发生较多。本病常为地方性流行性，多呈败血性，短期波及全群，如不进行及时防治，则发病率、病死率很高，慢性常为地方性散发性传染。通过病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验等，可对猪链球菌进行诊断。

人感染情况通常是散发，人感染猪链球菌并发病非常少见，目前全球只有200多例报告，私自屠宰、并密切接触病猪（宰杀、加工）和食用病猪肉是传播的主要途径。还可以通过伤口或蚊虫叮咬传播。吃了病死猪肉的病人不如直接接触病死猪的严重。宰杀过病死猪及直接接触过病死猪的发病者中，要比吃了病死猪肉的人发病情况更要严重。人感染猪链球菌病潜伏期短，平均2～3d，最短为数小时，最长为7d。病人感染后发病急，怕寒、发热、头痛、头昏、全身不适、乏力、腹痛、腹泻。外周白血细胞数升高，中性粒细胞比例升高，严重患者发病初期白细胞降低或正常。部分病例表现为脑膜炎，恶心，呕吐，严重者出现昏迷。脑脊液呈脓性改变，皮肤有出血点、淤点、淤斑，休克表现。发病初期表现高热、全身酸痛、高度乏力、食欲下降等症状，伴有轻微恶心、呕吐。猪链球菌2型本身还有不同的菌株，毒力因子各有不同，毒素水平不一样，致病的轻重也不一样。感染猪链球菌病患者的病情轻重取决于以下三个因素：一是感染细菌的毒力，二是感染细菌的数量，三是患者自身免疫力水平。

普通的细菌潜入人体发挥作用往往需要几天甚至一两周的时间，但有的猪链球菌2型菌株能产生7种“毒力因子”，导致感染的潜伏期非常短。四川此次发病最急的一名男性患者从接触到发病只有短短2h。许多患者迅速出现了严重的休克现象，并引发了肾脏、肝脏、肺脏、心脏等多脏器功能衰竭，很多病人来不及抢救就死亡了。

猪链球菌病在临床上有败血型、脑膜脑炎型、关节炎型、支气管炎型等。过去屡有败血型猪链球菌的报道，而关于集约化养猪场关节炎型链球菌病的报道较少。从患关节炎猪的关节液中能够分离出猪链球菌，山西岐山种猪场，约有60%的仔猪流行关节炎，严重者可发生败血症而死亡，给种猪场造成巨大的经济损失。病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体。从致病力试验结果可以看出，引起猪关节炎的猪链球菌的致病力较小，而引起败血症的猪链球菌的致病力较强。但通过生化试验和血清学鉴定，它们又是同种细菌且血清型也相同。为什么同种血清型的猪链球菌的致病力差别很大？这个问题还有待于进一步研究。

5.3.14.2 形态及染色特征

菌体球形或卵圆形，直径0.6～1.0μm，呈链状排列，短者4～8个细菌组成，长者有20～30个细菌组成。幼龄培养物大多可见到透明质酸形成的荚膜。无芽胞，无鞭毛，革兰氏染色阳性，在病料、鲜血琼脂培养物多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状（图5-3-44）。

5.3.14.3 生长要求及培养特性

37℃培养24h后，在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。需氧或兼性厌氧，有些为厌氧菌。营养要求较高，普通培养基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生长。最适温度37℃，最适pH 7.4～7.6，血琼脂平板上形成灰白、光滑、圆形突起小菌落，不同菌株有不同溶血现象。

5.3.14.4 生化反应

能发酵简单的糖类，产酸不产气。一般不分解菊糖，不被胆汁或1%去氧胆酸钠所溶解。这两种特性用来区别甲型溶血型链球菌和肺炎球菌。生化试验结果（参考本书链球菌章节和表5-3-29）。

5.3.14.5 抵抗力

55℃可杀死大部分猪链球菌，对一般消毒剂敏感，在干燥尘埃中可存活数日，对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素等均敏感，耐药性低。敏感的药物依次是：头孢菌素、青霉素、万古霉素、亚胺培南；中度敏感的依次是：洁霉素和卡那霉素；而对土霉素、链霉素、庆大霉素具有抗药性。

5.3.14.6 致病力

小白鼠注射血清肉汤培养物48h死亡。死亡后，小白鼠皮肤发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。背部皮下接种小白鼠，48h后处死，于注射部位有直径0.9～1.1cm的脓肿，脓汁呈黄绿色。

5.3.14.7 细菌学检测

基本同链球菌，参考《GB/T 4789.11—2003 食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验》。 首先在血琼脂分离菌株情况下，作生物化学试验，再结合血清学和动物试验来判定猪链球菌。也可以通过PCR方法快速检测猪链球菌。

5.3.14.8 食品加工过程中的综合控制

控制传染源（病死猪等家畜）、切断人与病（死）猪等家畜接触为主。防止宰杀病死猪或吃病死猪肉，对病死猪采取深挖、消毒和掩埋的无害化处理。

5.3.15 粪链球菌

5.3.15.1 食品卫生学意义

粪链球菌（Streptococcus faecalis）广泛分布于自然界，如人、动物的肠道中及粪便，植物表面、食品、土壤，特别在屠宰场所。发现阴沟污水中也有大量的本菌存在。粪链球菌是人和温血动物肠道正常菌群之一，往往和食物中毒有关。但其易于在食品和食品加工设备上繁殖，却很少表明为粪便污染。具有重要意义的是粪链球菌为发酵产品有益菌种之一，例如乳制品制造中，该菌可促使含酪胺的干酪成熟，并具特殊风味。因此对粪链球菌及其亚种的研究需要深入。

粪链球菌及其变种与人肠道的关系比其与动物肠道的关系更为密切，具有高度显示人粪污染指示的特性。屎链球菌、坚忍链球菌在猪肠道内的检出率比粪链球要高。牛链球菌、马链球菌分别在牛马的肠道内检出率也较高。人、猪、牛、羊的粪便中粪链球菌的检出率稍高于大肠菌群。粪链球菌还常见于不同温度的牛奶中，并参与牛奶的腐败变质，在10℃以下保存因细菌繁殖较慢牛奶很少出现凝固。高于这一温度时，因凝乳酶和产酸的共同作用，几天内形成凝块。在20℃时，细菌群中约90%由链球菌组成，致使牛乳迅速凝结。有的还参与牛奶的腐败变质：如在37～50℃时，粪链球菌参与牛奶变酸；粪链球菌液化亚种参与牛奶蛋白质分解，从而加速了腐败变质。

本菌引起的食物中毒，潜伏期常比沙门氏菌食物中毒短，但比葡萄球菌食物中毒长，症状比葡萄球菌中毒轻。发病快者仅1～3h，慢的达36h，平均6～12h，病程持续1～2d。主要症状有恶心、腹痛、下痢及偶尔呕吐，很快可恢复。引起粪链球菌食物中毒的食品，常见的是肉类和乳品，如新鲜肉、碎肉、乳酪、牛奶、冷冻海产、冷冻水果、蔬菜及果汁中均可分离到本菌，以前三种食品中最多。一般对人致病，对猪等没有致病性。

5.3.15.2 形态及染色特征

本菌为圆形或椭圆形，直径0.5～1.0μm，成双或短链排列，少数菌株有荚膜，无芽胞，肠球菌中有时也出现运动性菌株。革兰氏阳性，老龄培养可呈阴性（图5-3-45）。

5.3.15.3 生长要求及培养特性

为兼性厌氧菌，可在10～45℃生长，最适温度为37℃，pH 7.5。普通培养基上生长稍差，在培养基中需添加某些矿物质元素（如S、P），维生素B，氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸等）。在血液培养基或腹水培养基上生长良好。

葡萄糖肉汤：于37℃培养18～24h，呈均匀混浊生长。

血琼脂平板：菌落灰色、透明、圆形、凸起，表面光滑。其溶血性不定，有些菌株为β-溶血或γ-溶血，少数为α-溶血。

M-肠球菌琼脂（Slanetz或Bartley）简称ME琼脂；KF链球菌琼脂（Kenner），简称KF琼脂。D群链球菌在这几种平板上的菌落形态基本相同。

① 粪链球菌（包括变种）圆形，中央突起，边缘整齐，直径0.5～2mm，呈紫红色。10倍放大镜观察，菌落中心为暗紫色，四周有密集的暗紫色颗粒。

② 屎链球菌（S.faecium）菌落形态、大小与粪链球菌大致相同；菌落中央突起部呈粉红色，周围为灰白色。以10倍放大镜观察菌落，菌落中心呈红色，周围无色，其上有稀疏的放射状条纹。

③ 坚忍链球菌（S.durans）与粪链球菌相似，唯色更淡，呈淡粉红色。

④ 牛链球菌（S.bovis）与屎球菌相似。

⑤ 鸟链球菌（S.avium）与坚忍链球菌相似，只是菌落更小。

5.3.15.4 致病性

本菌的某些菌株可引起食物中毒。当食品中有大量活菌存在，即每克含有10⁸～10⁹个时，可使人发生中毒症状。本菌还可致泌尿道、胆管、伤口感染及败血症、心内膜炎、膜腔脓肿等病症。本菌对人有致病性，对猪等没有致病性。

5.3.15.5 抵抗力

对不良环境抵抗力：在冰冻食品、干燥食品中生存力高；能在6.5%NaCl肉汤中生长，可耐65℃30min。因此以肠球菌作为冷冻食品的指示菌具有其优越性。

5.3.15.6 生化特性

葡萄糖发酵产酸不产气，6.5%NaCl中能够生长，催化酶阳性，吡咯烷酮-β-萘基酰胺（PYR，阳性深红色）和LAP阳性，短链菌体，具有D抗原。胆汁七叶苷（asculin）反应阳性。

5.3.15.7 粪链球菌检验

食品中粪链球菌可参考图5-3-46肠球菌检验程序进行检验。

（1）直接镜检及活菌计数 直接涂片镜检（同其他食物中毒的检验）发现链球菌时，即进行倾注培养作粪链球菌计数。将检样以生理盐水作1∶10、1∶100、1∶1000稀释，分别用无菌吸管取各稀释度的悬液1mL，注入灭菌平皿，再将所制ME琼脂降温至50℃以下倾入已加样的平皿中各5～20mL，混匀，凝固后翻转平板置37℃培养18～24h，取出观察。如发现培养基上有米粒大小红色菌落，有光泽，边缘整齐，没有像溶血环样的圈，即疑为粪链球菌菌落，做好记录，算出每g固体检样的含菌数。

（2）分离培养 将检样分别接种于下述培养基：

① 血琼脂平板 划线接种后置37℃培养18～24h，观察菌落形态，挑选可疑菌落作鉴定。

② ME琼脂和KF琼脂 将检样稀释：如碎肉1g，加于100mL0.1%蛋白胨水内，振摇10min为母液。用母液作10倍稀释，将稀释液以无菌手续分别滴加于这两种琼脂平板表面，每个稀释度各加0.2mL，用灭菌L型玻棒将液滴涂布均匀，等样液干后，置37℃，培养48h，观察、记录菌落特征。

③ 葡萄糖肉汤 将上述可疑菌落作涂片镜检，为革兰氏阳性链球菌者，即接种于数支葡萄糖肉汤，置不同温度培养，并作胆汁及牛乳美兰还原试验等。

本菌一般对青霉素、链霉素及磺胺类等药物不敏感，而对氯霉素、金霉素和土霉素等较敏感。曾报道有少数急性心内膜炎患者由本菌所致，因此，当血琼脂等培养基上有疑似本菌时，应作鉴别，以便选取有效的抗菌药治疗。

5.3.16 椰毒假单胞菌酵米面亚种

5.3.16.1 食品卫生学意义

假单胞菌属（Pseudomonas）分类于假单胞菌科。假单胞菌在自然界分布十分广泛，大量存在于空气、土壤、淡水、海水、污水、食物、医院内潮湿的环境、动物和植物体表等，种类繁多，到目前为止已超过200种，为严格的需氧杆菌，也是人体内的正常菌群。某些菌株对人和动物致病，为条件致病菌，在临床上多见于烧伤、免疫抑制等患者的感染。假单胞菌属的菌种已证实对人和动物原发或机会致病菌有7种，即铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、鼻疽假单胞菌、洋葱假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌及腐败假单胞菌。假单胞菌属也常造成鱼肉、蛋、奶的腐败。由于本属有很多嗜冷菌适应低温生长，因而造成冷藏食品变坏、冷藏血浆的污染。本菌对植物的危害也颇广泛。

椰毒假单胞菌（Pseudomonas pocovenenans）是假单胞菌属的一个种，是1960年从印度尼西亚发酵食物Tempebongkrek中毒样品中分离并命名的一种食物中毒菌。椰毒假单胞菌在自然界分布广泛，产毒的椰毒假单胞菌检出率为1.1%，在玉米、臭米面、银耳、汤圆等都检出了本菌。它主要产生两种毒素：米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）和毒黄素（Toxoflavin rlavm，TF）。

椰毒假单胞菌酵米面亚种（Pseudomonas pocovenenanssubsp.farinofermentans）是引起酵米面食物中毒和变质银耳中毒的原因。主要中毒食品为发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其他变质淀粉类（糯米、小米、高粱米和马铃薯粉等）制品。椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒多发生在夏、秋季节，食品因潮湿、阴雨天气，贮存不当变质。中毒与进食量多少有关，未食用者不发病。此菌产生毒黄素和米酵菌酸两种外毒素耐热性很强，120℃高温处理1h仍保持毒力。进食量与中毒症状的轻重有密切关系，食150g以上者发病率100%，病死率40%～100%。发病急，潜伏期多数为2～24h。主要首发症状为上腹部不适，恶心、呕吐（呕吐物为胃内容物，重者呈咖啡色样物），腹胀、轻微腹泻、头晕、全身无力，重者出现黄疸、肝肿大、皮下出血、呕血、血尿、少尿、意识不清、烦躁不安、惊厥、抽搐、休克，一般无发热。继后表现以肝、脑、心、肾为主的多脏器损害。

5.3.16.2 形态及染色特征

假单胞菌属是一类革兰氏阴性、直或微弯的需氧杆菌。细胞呈卵圆、短杆状以至长杆状形态。大小一般为（0.5～1）μm×（1.5～4.0）μm。无柄、鞘和芽胞。以极鞭毛（单鞭毛或多鞭毛）而运动，少数菌无运动性。DNA的G+C含量（摩尔分数）为58%～70%。胞浆中含浓染颗粒及空泡。在透射电镜下观察，可见异染颗粒、脂质颗粒、板层状内膜结构等特殊结构。值得注意的是，板层状内膜系统仅见于少数菌属，如紫色光合细菌、硝化细菌、甲烷氧化菌等，其功能与光合作用及氧化磷酸化过程有关，在椰毒假单胞菌中的功能尚不清楚（图5-3-47）。

为有机化能异养菌，代谢为呼吸而非发酵，有些是兼性化能自养菌，能利用H₂或CO₂为能源。分子氧是普遍的电子受体，有些能脱氮而利用硝酸盐为替代的受体。除能利用脱氮作用以厌氧呼吸的一些种外，均为严格或专性需氧菌。菌苔虽不明显呈色，但部分菌可产生水溶性色素和荧光色素。

5.3.16.3 生长要求及培养特性

椰毒假单胞菌某些菌株在有硝酸盐环境中可呈厌氧生长。营养要求不严格，几乎所有菌群在铵盐和单一碳源环境中均可生长。生长温度为25～37℃，最适生长温度为37℃，最适产毒温度为26℃。PDA平板上生长，菌落大小为1～2mm，呈乳白色或灰白色，光滑，湿润，边缘整齐；培养48h后，中心有突起，呈草帽状或放射状花纹；菌落周围有黄绿色素产生并扩散到基质中。在365nm紫外灯下有黄绿色荧光。卵黄琼脂平板上生长，菌落表面光滑，湿润，48h后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射日光下可见环的表面呈虹彩现象。S.S琼脂平板不生长。

以脱脂椰肉为基质，接种椰毒假单胞菌，30℃下培养4d产生的米酵菌酸，可溶于石油醚中，用PHS的水萃取后调至pH 2～3，可再用石油醚或乙醚萃取，如此反复可得到较纯净的米酵菌酸。

5.3.16.4 生化特性

假单胞菌氧化糖类只产生少量的酸。蛋白胨糖水不适用于测定酸的产生，因为产生的酸常被蛋白胨分解产生的碱所中和。用铵盐培养基易测定酸的产生，因在该培养基中糖是唯一碳源。过氧化氢酶阳性。假单胞菌能产生和分泌许多胞外酶，包括蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶等。明胶酶的产生对分类很重要。

椰酵假单胞菌具有O、K、H三种抗原。很少发生交叉反应。O抗原为菌体抗原，耐热，凝集反应出现较慢，聚集物呈颗粒状。H抗原为鞭毛抗原，不耐热，凝集反应发生迅速，凝块呈疏松絮状。K抗原为表面抗原。在三种抗原中，研究得最多的是O抗原。迄今已证实该菌具有7种O抗原因子，划分为6种O抗原型。椰毒假单胞菌的血清型目前有O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ等。产毒与血清型有关，已知O-Ⅴ、O-Ⅳ、O-Ⅲ产毒。椰酵假单胞菌生理生化反应特性见表5-3-30。

5.3.16.5 抵抗力

在PDA上生长的椰酵假单胞菌，对金霉素、土霉素、四环素、庆大霉素较为敏感，对青霉素、红霉素、合霉素、氯霉素、新霉素具有很强的抗性。尤其是对革兰氏阴性菌的广谱抗生素——氯霉素，在适宜浓度下能使椰酵假单胞菌在PDA培基上生长更旺盛，显示了其菌体构造和新陈代谢体系的特殊性。椰酵假单胞菌对一般常用的消毒剂都很敏感，亚硫酸氢钠对椰酵假单胞菌具有较强的抑菌和杀菌作用，可用于某些食品加工过程的消毒。生物学方法抑菌研究发现，该菌的寄生菌k噬菌蛭弧菌和一种特异的瓜子形细菌均可以裂解椰酵假单胞菌。

BA去毒方法的实验室研究表明，次氯酸钙和过氧乙酸去毒效果较好，硫酸、次氯酸铜次之。陈晓明等报告了用日晒法去除银耳中BA的实验结果，鲜银耳日晒2d可去毒95%～97%，干银耳日晒2d去毒57%～62%，日晒8d去毒94%。在实验室条件下证实，短波紫外线照射对BA有明显去毒作用。

5.3.16.6 致病性

（1）致病物质

已证明椰毒假单胞菌酵米面亚种的致病物质是其在生长繁殖过程中向胞外基质分泌的两种毒素米酵菌酸（bongkrekic acid，BA）和黄毒素（toxiflavin，TF），均系小分子脂肪酸类毒素。

BA作为酵米面中毒和银耳中毒的病原菌产生的毒素之一，具有很强的生物活性，是椰毒假单胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物。米酵菌酸的毒性极强，小白鼠经口服LD₅₀为3.16mg/kg（95%可信限为163～615mg/kg体重），达到剧毒化学品的标准，因此由BA污染食品引起食物中毒的病死率高达80%左右。TF为839mg/kg体重。BA毒性比TF强，且在相同条件下，BA产生量远大于TF，是引起酵米面和变质银耳等多种食品中毒致死的主要病因。TF为8.39mg/kg，也达到强毒化学品之标准，且该毒素耐热性强，一般的烹调方法难以破坏。

BA为一种脂溶性酸性化合物，分子式为C₂₈H₃₈O₇，相对分子量486.61，化学名为3-羧甲基17-甲氧基6，8，21-三甲基二十二碳2，4，8，12，14，18，20-七烯二酸。纯净的BA为白色晶体（白色不定形固体），耐热性强，难溶于水，熔点为50～60℃，易溶于乙醚、石油醚、氯仿、甲醇等有机溶剂及碱性水溶液，对热稳定，对酸性条件、氧化剂和日光不稳定，易吸附于活性炭。BA具有旋光性，在2%的NaHCO₃溶液中比旋光度n22+165，在95%乙醇中为+105。毒性可随旋光度的消失而消失。BA的甲醇溶液对紫外光谱有两个吸收峰分别是：237nm（8～3200nm）和267nm（～36700nm），在铵盐溶液中则为239nm（ε=40600）和263nm（ε=40600）。一定条件下，BA可发生氢化及甲基化反应生成一系列衍生物，其中氢化型BA呈晶体状，性质稳定，旋光性与毒性均消失。

BA作用于胰腺β细胞抑制葡萄糖酶活性而造成高血糖，此后又可转呈为低血糖，严重者出现低血糖昏迷。BA除对线粒体有破坏作用外，还可使部分巯基酶失活，因此解毒时可使用L-半胱氨酸等巯基化合物恢复由BA所抑制的巯基酶活性，减轻或解除BA的毒害。此外BA具有抑菌作用，对霉菌、酵母及某些细菌均有强烈的抑制和杀灭作用，12.5μg量的BA即可在平板上形成明显的抑菌圈。

流行病学及实验室研究表明，BA可引起人和多种动物（如小白鼠、狗和猴等）的急性中毒，肝、脑、肾等实质性脏器是该毒素作用的靶器官，且以细胞内的线粒体最为敏感。临床症状表现为恶心、呕吐、腹痛、腹胀等，重者出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、抽搐、血尿、血便等肝脑肾实质性器官损害症状。重症病人多呈昏迷、中枢神经麻痹，并因呼吸衰竭而死亡。

（2）米酵菌酸的中毒机制

BA的毒性最早认为是干扰糖代谢，以后人们一直研究其机制。1959年welling等通过动物试验发现BA可抑制丙酮酸、α-酮戊二酸和苹果酸的氧化，对磷酸化过程的抑制更为明显。1970年Henders以大鼠线粒体为材料证明了对氧化磷酸化的抑制部位不在呼吸链，而是线粒体膜上的ADP转运过程。Weidemann发现BA增加ADP与线粒体内膜的亲和力，阻断ADP转运。Lauquin则证明BA在线粒体内膜上与ADP载体形成复合物。吴洪娟等认为由于BA与腺嘌呤载体ANT（电压依赖性阴离子通道）的结合，成为ANT的特异性非竞争性制剂，阻碍了ADP与ATP在线粒体内膜的交换，使ATP生成减少或消失；由于缺乏ATP，细胞膜上离子泵不能发挥正常功能而效率低下，引起细胞内水钠潴留，细胞水肿；线粒体内膜依赖ATP的机制停止工作，造成水钠潴留，从而引起线粒体肿胀，嵴变短、模糊直至消失。作为细胞内进行呼吸作用和能量交换的重要场所及细胞内主要的供能器官——线粒体，它的功能消失必将导致细胞、机体的死亡。ANT在PTPc复合物的形成、开放和调节细胞凋亡过程中具有关键性的作用。BA正是通过作用于ANT使其构型发生改变，抑制PTPc的开放进而抑制凋亡因子的释放从而起到抑制细胞凋亡的作用。由此开启了BA研究的新篇章。BA在细胞凋亡的研究和抗肿瘤药物的研制过程中得到了广泛应用。

酵米面中毒目前尚没有快速检测BA的方法及特效的临床诊断、治疗方法。但有文献报告血浆置换治疗酵米面中毒。其可能机理为用正常血浆置换含有毒素的血浆，减少毒素对各脏器的损害，并提供凝血因子。

（3）中毒表现

发病初期，多为胃部不适，恶心、呕吐、头痛、头晕、全身无力、心悸等。体温一般不高，少数病人于发病后数小时有中等度发热。稍晚则表现为肝、肾、脑、心等实质脏器受损害的症状。

① 消化系统症状 出现早，常在进食后数小时出现。以胃部不适、恶心、呕吐、腹胀、食欲不振为常见。腹泻轻微，部分病人有便秘或血便。呕吐物为臭米面食物，后变为咖啡样物。黄疸在病后2～3d出现。此时肝肿大，伴有肝区痛。

② 神经系统症状 出现早，最多见为头痛、头晕、精神不振。严重者嗜睡、意识模糊、抽搐、甚至昏迷。部分病人眼球突出、球结膜水肿、脑内压升高等脑水肿症状。神经系统症状常与出血、休克伴随出现，为危重表现之一。

③ 循环系统症状 以休克、低血压为多见。

④ 泌尿系统症状 有轻重不等的肾脏受损的表现。早期有红细胞出现，同时有白细胞、蛋白质尿及管型尿出现。重者继而出现少尿、闭尿和血尿，水肿，血压升高。最后肾功能衰竭而死亡。

⑤ 呼吸系统症状 发绀、呼吸困难、出现中枢性呼吸衰竭症状。

⑥ 皮下及黏膜出血 消化道、脑膜、肝、肾实质脏器出血。

本菌一旦发生食物中毒，病死率很高，一般在50%以上，最高可达100%。死亡最早发生进食后3～5h，一般多发生在发病后1～2h。

5.3.16.7 细菌学检查

（1）食品卫生微生物学检验

椰毒假单胞菌酵米面亚种食品卫生微生物学检验根据GB/T 4789.29—2003。本标准适用于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉类发酵食品引起食物中毒的病因学诊断及椰毒假单胞菌酵米面亚种的常规检验及菌种鉴定，并进行血清学分型（图5-3-48）。

首先是根据细菌的形态学特征及生理生化性状，然后进行血清学分型鉴定。用多价血清做玻片凝集试验，与多价血清凝集者，依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ等因子血清做试管凝集试验，以判定O抗原型。在生理盐水中自凝的菌株不能被分型。生化性状符合，但不能与以上血清凝集者，需进一步作产毒培养和毒素测定。

分离鉴定：方法按食物中毒的细菌检验方法进行。将所采取的标本接种PDA平板，同时将检样以1∶10接种于1%葡萄糖肉汤，经36℃，18～24h增菌后再划种于PDA平板进行分离。平板经36℃，24～48h培养，挑选可疑菌落接种PDA斜面36℃，24h纯培养。结果典型菌落在PDA平板上为灰白色，光滑、湿润、圆形凸起，边缘整齐，产生黄绿色色素，扩散到基质中，室温放置2～3d，可见到沉淀带。革兰氏染色为阴性小杆菌。

卵磷脂酶试验：取PDA斜面上的纯培养物点种在卵黄琼脂平板上，36℃ 48h培养，在菌落周围有混浊环，环的表面有特殊的虹彩环。

色素观察：将此菌接种在沙保若氏平板上，26℃ 48h培养，可见菌落呈黄绿色，色素扩散到基质中。

O/F试验：将此菌接种二支1%葡萄糖半固体发酵培养基，其中一支表面加灭菌液体石蜡以隔绝空气，二支管同时36℃培养24～48h。无液体石蜡管产酸，有液体石蜡管无变化，为氧化型。

生化反应：将此菌接种于生化培养基，36℃ 2～4d培养，结果该菌分解葡萄糖，阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇、甘露糖、山梨醇；不分解果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、木糖；ONPG、尿素、明胶，果胶均为阳性，吐温-80水解，但不水解淀粉；能利用苹果酸、酒石酸和柠檬酸；氧化酶、甲基红、VP、MR、苯丙氨酸均为阴性；不产生靛基质、H₂S生长，在5℃和41℃不生长。

血清学鉴定：按常规方法与椰毒假单胞菌酵米面亚种因子血清进行玻片凝集试验。

动物中毒实验：将疑似中毒鲜银耳直接喂饲兔子，4h后发病，兔子精神萎靡、躁动、走路不稳，肢体瘫痪、血尿、抽搐，9h后死亡。进行解剖，肉眼观察主要内脏器官心、肺、肝、肾广泛水肿，充血、出血。

（2）操作步骤

① 增菌 用无菌操作取样品25g，加入盛有225mL增菌液的500mL三角瓶中（鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mL增菌液的100mL三角瓶中）放（36±1）℃培养48h。

② 分离、纯化培养 取增菌液1接种环，划线接种PDA平板，（36±1）℃培养24～48h。观察平板上生长菌落的形态，挑取可疑单个菌落，进行革兰氏染色及氧化酶试验。革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板及S.S琼脂平板，（36±1）℃分别培养48h和24h。

从卵黄琼脂平板挑取卵磷脂酶阳性，并带有虹彩环的单个菌落，接种PDA斜面，（36±1）℃培养24h，供下步试验用。

③ 生化试验 从纯培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种Hugh-Leifson培养基、蛋白胨水、缓冲蛋白胨水、西蒙氏柠檬酸盐培养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基，（36±1）℃培养，按单项试验的要求分别进行观察。

④ 血清学分型鉴定

a.O抗原的制备：将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面（36±1）℃，24h培养物用灭菌生理盐水洗下，煮沸2h，再用灭菌生理盐水稀释至5亿～10亿个/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。

b.O抗原的鉴定 用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用O—Ⅲ、O—Ⅳ、O—V、O—Ⅵ、O—Ⅶ、O—Ⅷ因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定O抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。

生化学性状符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步的鉴定。

⑤ 毒性试验

a.产毒培养：取已鉴定为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株接种PDA斜面，（36±1）℃，培养24h，加入3mL灭菌生理盐水，制成约100亿个/mL的菌悬液，用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好灭菌玻璃纸的半固体PDA平板上用灭菌L形玻璃棒涂布均匀，（26±1）℃培养5d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板放入消毒锅内，100℃流动蒸气灭菌30min。室温冷却后，置-10～-20℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用灭菌吸管取出冻融液，经滤纸过滤放灭菌试管或三角瓶中，4℃避光保存，此为粗毒素。

b.毒力测定：取粗毒素或经水浴蒸发的5～10倍浓缩液0.5mL，灌胃小白鼠3只，体重18～20g，观察7d。若菌株产生米酵菌酸，小白鼠在灌胃后20min～24h内发病、死亡。主要症状为竖毛，萎靡不振，继而躁动，行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。

c.米酵菌酸测定：按照GB 11675执行。

（3）米酵菌酸BA的检测方法（分子生物学检测）

菌体抗原的多克隆抗体、单克隆抗体的制备及酶联免疫吸附试验方法的应用，使椰酵假单胞菌血清学的分型研究和菌体抗原检测手段进入了一个新阶段。刘秀梅等在制备了抗不同血清型菌体抗原的抗体和辣根过氧化物酶结合物的基础上，建立了检测椰酵假单胞菌的间接非竞争、直接非竞争和双抗夹心ELISA法。其中单克隆抗体间接ELISA法初步应用结果表明，经生化试验鉴定为椰酵假单胞菌的菌株，100%含有O-I因子。联合使用种间（OI）和型间特异性单克隆抗体进行ELISA检测，可同时定种分型，方法灵敏，快速，重复性良好。

实验室常用薄层层析法或高压液相色谱法鉴定BA。胡文娟等建立了BA的TLc和HPLC测定法，其方法灵敏度为0.25μg/mL；最低检出量为0.2μg与0.4μg。王夏等建立了BA的紫外分光光度测定法，最低检出浓度为2.5μg/mL；标准曲线的线性范围0.5～30μg/mL。王夏和孟昭赫建立的BA微生物测定方法，以黑曲霉为测定用菌株，用纸片法测定，BA的最低检出量为0.38μg；在0.5～9μg范围内与HPLC结果比较，相对误差平均为±11.2%。此法简便易行，样品无需复杂的纯化处理，便于基层大量样品的筛选。Lin Liming等用线性结合函数紫外分光光度法同时测定BA和TF，提高了同时分析多种化合物的混合物的选择性、灵敏度和精确度。BA和TF的最低检出浓度分别为2.65μg/mL和2.24μg/mL，线性检测范围为2.65～9.28μg/mL和2.24～13.4μg/mL。

刘秀梅等制备了米酵菌酸牛血清白蛋白结合物（BSA-EA）、卵清蛋白结合物（BA-EA），经免疫后，获得了抗BA半抗原的多克隆抗体，血清效价可达1∶12×10⁴和1∶8×10⁴。建立的检测BA的直接和间接竞争ELISA法，最低检出浓度分别为0.1μg/mL和0.01μg/mL，线性范围分别为0.1～1μg/mL和0.01～1μg/mL。间接法的最低检出量可达1ng/孔。运用杂交瘤技术，刘秀梅等又成功地获得了抗BA单克隆抗体细胞株。BA多克隆抗体和单克隆抗体的制备成功及ELISA检测方法的建立，为椰毒假单胞菌食物中毒提供了快速诊断方法。

5.3.16.8 食品生产的综合控制

椰毒假单胞菌食物中毒是一种细菌毒素性中毒，是我国农村、山区多发的一种食物中毒，其病死率远远高于其他常见细菌性食物中毒。在经济落后、生活水平低下、食物原料单一的地区，居民往往粗粮细作，自制发酵类食品。由于加工方式不当，食入了被椰毒假单胞菌及其毒素污染的食品而导致中毒的发生。这些地区偏离文化中心，不能及时得到预防该类食物中毒科学知识的传播是中毒屡屡发生的原因之一。随着流行区域的不断扩大、不同地区间居民饮食习惯、食品加工方法的不同，陆续发现的中毒食品大致可分为三大类。即，谷类发酵制品（发酵玉米面、糯玉米汤圆粉、玉米淀粉、发酵糯小米、醋凉粉等）、变质银耳及薯类制品（马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等）。实验室研究曾发现玉米、银耳粉、土豆粉、黄豆粉、高粱米、大米等8种常见食物及马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基是适于椰毒假单胞菌生长、产毒的基质。不同糖分与椰毒假单胞菌菌株的产毒能力密切相关，3%～5%葡萄糖能促进菌株产毒能力的提高。实验室研究结果与中毒流行情况高度统一的事实提示我们，应警惕并预防新的食物种类引起中毒的发生。

椰毒假单胞菌食物中毒的病原是该菌的主要代谢产物米酵菌酸，它耐热、毒性强，不能被一般的烹调方法所破坏。应充分发挥我国三级医疗保健网的优势，培训更多最基层医疗保健工作者。在实际生活中应注意避免有利于该菌生长、产毒的环境条件和食品加工方式，以预防食物中毒事件的发生。按照汉族糯米粉制作方法，浸泡1d，打粉或磨浆滤水后当日吃，或在太阳下曝晒快速干燥，可避免椰毒假单胞菌酵米面亚种产毒。不用霉变的玉米等制备酵米面，谷类浸泡时要勤换水，保持卫生；注意勿食用变质鲜银耳，存放时要通风、防潮，发好的银耳要充分漂洗，摘除银耳的基底部。彻底改变那种一次大量制作酵米面粉贮存多日多次食用的不良风俗，提倡现作现吃，一次食完，是预防酵米面中毒的有效措施。保证食品原料的卫生质量，严格控制适宜该菌生长、产毒的客观条件，并监测食品中米酵菌酸的含量是预防椰酵假单胞菌食物中毒的重要环节。

5.3.17 河弧菌

5.3.17.1 食品卫生学意义

根据流行病学调查，河弧菌（Vibro fluvialis）是水产养殖中常见的主要病害之一，自从1975年Furniss等分离到该菌以来，人工养殖的鲍鱼、虾、贝类、鱼等的弧菌病国内外均有报道。河弧菌在弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血性弧菌，是沿海地区腹泻病和食物中毒的重要病原菌，尤其是港湾地区，故被认为是全球性港湾地区水源性微生物。河弧菌属不凝集弧菌，广泛分布于海水和稍带盐水的港湾水、河水。龙虾和小虾最常见，其他如鱼、蟹、牡蛎、蛤、蚶、螺等也存在污染，再就是被海产品或工具污染的熟食品。

食用生鱼或海产品加热不彻底，或食入被海产品、水产品污染的食物为传播媒介，可引起腹泻病的发生。婴幼儿、青少年易感染，也可发生在无海水接触史及未食海产品的患者中，多为散发性腹泻。中毒潜伏期一般为13～14h。症状以腹泻和呕吐为主，腹泻为水样便，可持续1～4d，少数便中有血液和黏液，大多数病人中度脱水。国内报道的食物中毒多为淡水源或淡水产品污染所致，如1983年徐州市两煤矿因供水系统污染，导致780人的河弧菌腹泻；连云港市曾因猪头肉污染而引起几十人中毒。其后在上海、福建闽东地区、新疆等地都有检出。福建省1988年调查指出，共检验729份，海产品46份阳性，占6.3%，其中贝壳类为197份，12份阳性，占6.1%；甲壳类214份，14份阳性，占6.5%；鱼类318份，20份阳性，占6.3%。生物Ⅰ型占89.1%，生物Ⅱ型占10.9%。上海腹泻病人粪便中的分离率为1.2%，近海鱼的带菌率为1.5%～30%。

美国曾将河弧菌称EF-6群弧菌，英国将其称为F群弧菌菌株，1980年命名为河弧菌。河弧菌属嗜盐菌，它们的自然栖息地位于温暖的海滨及港湾的水域，偶尔在内陆的含盐水中也能发现，美国东海岸从墨西哥湾到科德角，日本大部地区及我国东南沿海地区的自然气候条件（气温>20℃，海水含盐量0.7%～1.6%）是弧菌生长的适宜条件，大多数食物中毒的报告来自此地，少数病例发生于美国西海岸较冷的水域。有报道在英格兰海岸也能发现这些嗜盐菌。

5.3.17.2 形态和染色特征

菌株为革兰氏阴性杆状或略弯曲杆菌，有时为短杆状，无芽胞，无荚膜，兼性厌氧。大小为（0.6～0.7）μm×（1.2～1.5）μm，以单根极生鞭毛运动。能产生不耐热肠毒素。悬滴标本观察动力，活动似穿梭样（图5-3-49）。

5.3.17.3 生长要求和培养特性

生长温度均为15～42℃，最适温度为30～37℃；在pH6～11范围内均可生长，pH为6时生长最佳；菌株可在1%～7%NaCl浓度范围内生长，2%～3%NaCl浓度生长最好，无NaCl的培养基中不生长。

在1%～3%（W/V）的普通培养基上生长最佳。在S.S琼脂平板上生长，菌落为无色半透明，边缘整齐。直径1mm左右。在TCBS琼脂平板上菌落呈黄色，光滑，边缘整齐，直径1.3mm左右。在碱性胆盐琼脂平板上，菌落呈无色透明，边缘整齐，直径在0.7～1.3mm。

5.3.17.4 生化反应

氧化酶、接触酶、双水解酶、葡萄糖的O/F、葡萄糖产酸、硝酸盐还原、黏液丝、蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、精氨酸，3%NaCl、7%NaCl阳性；对O/129（2，4-二氨-6，7-二异丙基喋啶）（150μg）敏感；乳糖、靛基质、水杨素、赖氨酸、鸟氨酸、葡萄糖产气、木糖、肌醇、明胶液化、10%NaCl阴性。见表5-3-31。

目前，河弧菌分成Ⅰ、Ⅱ两个生物型，发酵葡萄糖不产气、能水解七叶苷者为Ⅰ型，常见于人的粪便；反之为Ⅱ型，又称弗尼斯弧菌（V.furnissii），常见于牛、猪兔的粪便。这些菌株在血琼脂平板上都呈现溶血现象。本菌有特异的O抗原和共同的H抗原，根据本菌的O抗原不同进行血清型分型。国内报道，从人粪便分离出来的血清型有：FV₁、FV₇、FV₈、FV₉、FV₁₁、FV₂₅、FV₂₈等。

5.3.17.5 抵抗力

药物敏感试验：青霉素、氨苄青霉素和洁霉素耐药外，对链霉素、红霉素中度敏感，对氯霉素、四环素、卡那霉素、头孢霉素、新诺明和萘啶酸等高度敏感。

在水中可存活2周至一个月，对干燥、热、日光及消毒剂敏感，干燥后极易死亡，煮沸100℃立即死亡，直射阳光下数小时死亡。对氯敏感，耐碱，对酸敏感，正常胃酸中仅能存活几分钟。对大多数抗生素敏感，如链霉素、氯霉素及四环素敏感。

5.3.17.6 致病性

河弧菌与气单胞菌在生化性状方面有许多相似之处，而且二者同属于弧菌科，彼此可有部分共同抗原。吸收处理的河弧菌多价血清以及单价分型血清发生迅速的强凝集反应。腹泻病人的带菌率为3.75%，健康人带菌率为0.25%。河弧菌引起人的疾病主要是胃肠炎，导致腹泻、呕吐为主的表现。腹泻为水样便，少数便中有血液和黏液，腹泻可持续1～4d，大多数2d左右。还有的有腹痛、发热，但发热的病人不多。

青岛市北区卫生防疫站，烟台市芝罘区卫生防疫站首次从遗传角度提出霍乱CT和溶血素为河弧菌致病因子的论据（表5-3-32）。

CT毒素：小鼠肠袢试验、小鼠致病力试验均为阳性反应。

5.3.17.7 细菌学检测

按GB 4789.7—2013食品安全国家标准 食品微生物学检验 参考副溶血性弧菌检验操作（图5-3-50）。

5.3.17.8 综合控制

主要是对水产品贮藏的温度控制，注意要低温，吃海产品时一定要彻底加热，在海产品加工时要防止再污染。食品加工时要注意加工水的卫生质量。

5.3.18 拟态弧菌

5.3.18.1 食品卫生学意义

拟态弧菌（Vibro mimicus）又称模拟弧菌，1981年美国疾病控制中心肠道小组的Davis等人发现的一个新种，在形态和培养特性上与霍乱弧菌相似。拟态弧菌分布很广，多呈散发或暴发，一年四季均有发病，以夏季为多。发病年龄不限，但少儿少见。发病者多有吃生牡蛎、虾蟹史，以牡蛎和小龙虾多见，水螨、贝壳类也能够分离到。该菌引起的食物中毒季节集中在夏秋季，传播媒介主要为海产品，该菌可引起某些地区的散发性、流行性腹泻和食物中毒暴发。可从美洲的水域和水生贝类动物分离到，还曾在孟加拉、墨西哥、新西兰、关岛、加拿大和亚洲国家及地区分离到。国内山东、福建和江苏等省都有中毒的报道。日本国已将此菌列为食物中毒中必须检验的病原菌，我国1987年首次从中毒食物中检出并作出证实为食物中毒病原菌。

5.3.18.2 形态及染色特征

该菌为革兰氏染色阴性，单极毛，菌体略弯曲，革兰氏阴性杆菌。悬滴标本镜下动力十分活泼。其形态学及DNA序列与霍乱弧菌极相似，但生化反应不典型，故取名为拟态弧菌（图5-3-51）。

5.3.18.3 培养特性

在S.S琼脂平板、麦康凯琼脂及普通营养琼脂平板上37℃生长良好。TCBS琼脂平板上37℃48h生长的菌落为绿色，不分解蔗糖，直径1.0～2.5mm，圆形、凸起、光滑、湿润，在兔血琼脂平板呈β溶血（表5-3-33）。

5.3.18.4 生化特性

在TCBS琼脂培养基上不分解蔗糖，菌落呈绿色，运动活泼，氧化酶试验阳性，赖氨酸及鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸水解酶阴性，发酵葡萄糖产酸不产气，V-P试验阴性，对150μg O/129敏感，能在无盐胨水、3%及6%NaCl胨水中生长等特征，见表5-3-34。

5.3.18.5 抵抗力

该菌对氟哌酸、四环素、氯霉素、庆大霉素、链霉素和红霉素等常用抗生素敏感，对多黏菌素B、青霉素、萘啶酸和卡那霉素耐药。

5.3.18.6 致病性

拟态弧菌的致病性并不是取决于某一毒力因子，而是在病原菌侵袭宿主而致宿主发病的过程中各种毒力因子在分子水平上协同作用的结果。

目前已知的该菌毒力因子有黏附素、内毒素、外毒素和其他毒力因子。

① 黏附素 拟态弧菌的黏附素（adhesins）有鞭毛、菌毛、外膜蛋白（OMPS）、血凝素等。拟态弧菌运动活泼，在电镜下观察可见菌体一端有单鞭毛，少数菌体两端各有1根鞭毛，长而柔软，呈波浪状，细菌可借助于鞭毛黏附于消化道（特别小肠）黏膜上皮细胞表面，与其相应受体结合，在局部繁殖而产生其他毒力因子，最终导致宿主感染。其鞭毛具有抗原性，与霍乱弧菌的H-Ag具有共同的抗原决定簇。

② 内毒素 拟态弧菌内毒素是其细胞壁中的脂多糖（LPS）成分，由3部分组成：即O特异性链、非特异性核心多糖和类脂A。O特异性链为LPS的最外层，具有抗原性由糖残基组成，称为O-Ag，与霍乱弧菌O多价血清不凝集。核心多糖的分子量为14～16kDa，含葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺、庚糖、阿拉伯糖、乙醇胺、磷酸等，缺少2-酮基-3-脱氧辛盐碱（KDO），具有属特异性。多糖成分仅具有血清学特性，与血凝性有关，因此其血凝性为多糖成分的首要生物学功能。类脂A由葡萄糖胺、阿拉伯糖胺、乙醇胺、磷酸和脂肪酸组成，是其生物学活性主要成分。LPS毒性作用和其他革兰氏阴性菌（GNB）的LPS毒性作用相同，主要有致死性、热原性、补体激活作用、血凝性、弥漫性血管内凝血等。

③ 外毒素 拟态弧菌通过各种黏附素共同作用牢牢固着在宿主细胞上，进行生长繁殖并合成、分泌胞外毒力因子，它是拟态弧菌重要的毒力因子，有毒性酶类、肠毒素和溶血素等，外毒素有耐热和不耐热两种。

④ 胞外酶 拟态弧菌产生的毒性胞外酶种类很多，包括明胶蛋白酶、酪蛋白酶、金属蛋白酶、卵磷脂酶（Tween 80）、几丁质酶、血浆凝固酶等。这些胞外酶在细菌致病中是必不可少的，其致病作用主要包括分解破坏宿主组织成分，以利于病原菌的进一步侵袭；破坏机体血淋巴凝血系统的酶活性，影响红细胞功能；破坏血清的免疫功能等。

⑤ 肠毒素 拟态弧菌肠毒素有不耐热肠毒素（CT样毒素）、耐热肠毒素（ST）、ACE和ZOT毒素4种，虽然它们的生物学特性不完全相同，但具有相同的致病性，均能引起小肠内肠液聚集，导致水泻样或痢疾性腹泻。一些拟态弧菌株并不产生肠毒素，但能抵御肠道正常的防御功能而引起宿主发病，原因是细菌产生了小肠集落因子。

⑥ 溶血素 在拟态弧菌的胞外产物中已分离到耐热的溶血素和不耐热的溶血素（VMH）2种。前者与副溶血弧菌所产生的耐热溶血素（TDH）很相近，后者是分子量为63kDa的多肽，与霍乱弧菌具有肠毒性溶血素抗血清发生交叉反应，对多数哺乳动物红细胞都具有溶血活性，其中对马红细胞活性最高。拟态弧菌不耐热溶血素VMH的溶血作用机制与创伤弧菌溶血素相似。

⑦ 铁载体 拟态弧菌可产生一种铁载体（siderophore），该物质能吸附和螯合微量铁，以供细菌生长繁殖。拟态弧菌产生的溶血素可使血液中的游离血红蛋白和铁元素增加，因此这两种毒力因子相互作用，使宿主体内的铁消耗增加，从而加重病症。

5.3.18.7 细菌学检测

参考河弧菌或霍乱弧菌检验程序。

5.3.18.8 综合控制

餐饮从业人员卫生，注意食品的采购保存，严格遵守食品卫生法规定。卫生监督人员严格执行食品卫生法，加强监督指导，发现问题严肃处理。顾客在用餐前先看一下食品是否新鲜、有无异味，特别是海产品，要完全煮熟后才能食用；有关媒体也要多宣传一些卫生常识。这样就可大大减少食物中毒的发生，从而提高健康水平。整个控制措施基本同霍乱弧菌和河弧菌。

5.3.19 创伤弧菌

5.3.19.1 食品卫生学意义

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）与副溶血弧菌很相似，常从海水、鱼类、贝壳类分离到。目前世界上大部分沿海国家都有创伤弧菌感染的病例报告，主要分布于近海和海湾的海水、海底沉积物及内陆咸水湖中。创伤弧菌对人类引起的感染主要有败血症和软组织感染，由于感染途径不同，临床症状也有差别：一是经口感染，能迅速通过肠黏膜侵入血液，引起原发性败血症，表现发热、畏寒、衰竭等症状；二是通过皮肤伤口侵入，首先在伤口周围出现红斑，继而表现急性炎症，皮肤病变明显，最终引起败血症，但没有呕吐、腹泻等副溶血性弧菌的中毒症状。创伤弧菌食物中毒的潜伏期一般在24～48h，消化道外感染后不出现消化道症状为本菌区别于本属其他菌的一大特点，也是一种食源性感染菌。为便于与其他弧菌比较，故放在此处论述。创伤弧菌感染有明显的季节性，主要集中在每年的5～8月份，常见于水温20℃，含盐为0.7%～6%的海水中。因这段时间水温较高，有利于细菌的繁殖，感染者多为从事渔业或水上活动爱好者。创伤弧菌易感人群为慢性肝脏病（如肝硬化、酒精性肝病）、血友病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性肾衰、消化性溃疡、滥用甾体类激素、器官移植受体等患者，有这些基础疾病患者感染创伤弧菌的危险性比正常人大80倍。

本菌对于糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、肝炎及原因不明的肝功能障碍或其他重病患者的危害也相当严重，正因为如此，创伤弧菌食物中毒在一些国家（尤其是美国）备受关注。在我国，近年来也发现了由创伤弧菌引起的急性腹泻暴发和散发病例的报道。

中毒的食品多为海产软体动物，特别是牡蛎，国内一些海产品带染率为2.1%。食入的半生或生的牡蛎等引起食物中毒。1995年辽宁报道在甲壳类、贝壳类海产品中检出率为2.8%。交叉污染也可引起本菌的食物中毒。

5.3.19.2 形态和染色特征

该菌染色形态为革兰氏阴性，逗点状，单极端，单鞭毛，无芽胞，无异染颗粒，未发现荚膜（图5-3-52）。

5.3.19.3 生长要求和培养特性

该菌最适宜的生存条件为37℃下，10～20g/L盐度。其生化特征与副溶血性弧菌和溶藻弧菌极为相似，其中最显著的不同点为该菌能发酵乳糖，故曾称之为乳糖发酵弧菌。初代培养难于形成。在液体培养基中呈均匀混浊生长，在营养及碱性琼脂中生长丰盛，菌落呈圆整突起，光滑湿润，混浊不透明，浅青灰色。在血平板上有较大且明显的溶血环，24h菌落细小、光滑、边缘整齐、扁平突起。48h部分菌落顶端凹陷、皱褶、凹陷正中又有一小岛突起，呈双层状，部分仍呈光滑型。皱褶部份进一步扩大成整个菌落，其皱褶特征以NaCl肉汤培养物接种更为明显。在XLD、MC、HE上生长良好，菌落与典型肠杆菌基本相似。S.S上不生长，在庆大霉素及4号琼脂平板上均生长较好，呈典型弧菌属菌落特征。在TCBS上生长良好，为光滑湿润之蓝绿色较大菌落（表5-3-35）。

5.3.19.4 生化特性

阳性反应的有：氧化酶、接触酶、拉丝试验，43℃半乳糖、硝酸盐还原、水杨素、靛基质、明胶液化、甲基红、枸橼酸盐、赖氨酸、鸟氨酸、动力、葡萄糖产酸、乳糖、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、海藻糖、ONPG，需氧与厌氧均能生长，O/F葡萄糖为发酵型；与霍乱弧菌和河弧菌不同的是能发酵乳糖。

阴性反应的有：V-P，H₂S、尿素酶、苯丙氨酸、精氨酸、丙二酸盐、葡萄糖产气、侧金盏花醇、卫矛醇、赤藓醇、鼠李糖、肌醇、棉子糖、山梨醇、蔗糖、木糖、七叶苷、黏液酸、酒石酸盐、醋酸盐、DNA酶、黄色素、阿拉伯胶糖。

嗜盐性试验：0g/L NaCl肉汤、80g/L NaCl肉汤、100g/L NaCl肉汤不生长，30g/L NaCl肉汤、60g/L NaCl肉汤生长（表5-3-36）。

5.3.19.5 抵抗力

该菌对冷敏感。对青霉素、妥布霉素、苯唑青霉素、氨苄青霉素、多黏菌素B、丁胺卡那霉素、杆菌肽耐药；对四环素、红霉素、麦迪霉素、磺胺类、庆大霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、萘啶酸、先锋霉素V、氯霉素敏感。在发病24h内使用有效抗生素常有良好疗效。如局部已感染，应以局部消毒和全身用药相结合；如已发生败血症，可大剂量应用抗生素。增加饮水量，加大排泄，提高身体抗病力，可以抵抗该病，有利于康复。

5.3.19.6 致病性

（1）毒素 创伤弧菌的致病机理尚不十分清楚，其产生的一种多糖被膜能抵御吞噬细胞的吞噬和消化，可能是其致病力的基础物质。它产生的细胞外蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、细胞溶素、细胞毒素等都可能是致病因子。借助于这些致病因子的作用，创伤弧菌能迅速地穿过肠黏膜入血，引起败血症和蜂窝织炎。

① 溶细胞毒素 溶细胞毒素是一种创伤弧菌分泌的相对分子质量为5.1ku的水溶性的多肽，这种亲水蛋白质不耐热，胆固醇或蛋白酶可使之失活。很多研究表明，溶细胞毒素是创伤弧菌致病的重要因素之一，纯化的溶细胞毒素对多种哺乳动物的红细胞有溶细胞作用。

② 胞外酶 属胞外蛋白酶。加热60℃10min可使之失活。该酶具有出血活性和增强血管通透性作用，与皮肤损伤有密切关系。

③ 弹性硬蛋白酶 是胞外蛋白酶的一种，有助于病菌侵入含有弹性硬蛋白和骨胶原的组织，该酶与感染局部发生组织坏死有关。

④ 铁载体 创伤弧菌的致病性与其获得的铁密切相关。此种摄铁能力系由菌体的铁载体所介导，使菌能吸附和螯合宿主体内的微量铁，以供菌生长繁殖之需。而溶细胞毒素可使血液中的游离血红蛋白和铁元素增加，这两种毒力因子相互协同，使病人体内的铁消耗骤增，提高了患者的死亡率。

（2）抗原 创伤弧菌菌株均具有共同的鞭毛抗原和多种菌体抗原，Shimada等通过对70株创伤弧菌的血清学分析已证明了7种菌体抗原。血清型的鉴别有利于追踪污染源和传染途径，是流行病学调查方面唯一可靠的方法。

（3）中毒表现 食物中毒表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、水样便，一般无发热。

还有一种比较恶性的感染，初期发热、寒颤、痉挛性腹痛、肌肉痛，后为败血症或蜂窝织炎、出血性大疱、休克、甚至死亡。病死率可高达60%。

5.3.19.7 细菌学检测

食物中毒样品的检测程序与霍乱弧菌或副溶血性弧菌（或河弧菌）相同。

由于所有创伤弧菌抗O血清中均含有粗糙凝集素，因此，诊断血清在使用前必须先用粗糙抗原吸附。对分离的菌株要进行血清学试验，发病后30d患者血清与分离菌凝集效价1∶4。对分离的菌株还要进行动物试验，挑取分离菌血平板上菌落以无菌生理盐水制成约9×10^-1g/mL菌液，腹腔注射0.5mL，20～23g重小白鼠2只，后腿肌肉注射1只，注射后小鼠应该出现俯伏、懒动、毛颤抖等症状，18～24h小白鼠先后死亡。尸解能够从心、肝、肺、肾分离到注射菌。

该菌小岛型的皱褶菌落与斯氏假单胞菌的平向型和类鼻疽假单胞菌的菊花型也极易区别，而与副溶血弧菌的R型菌落相似。

5.3.19.8 综合控制

与海水及海产品接触是导致本病感染的主要途径，减少接触是预防和降低本病发生的有力措施。宣传进食生的或未加工熟的海产品对人的健康的危害，特别要提醒肝病等高危人群生食海产品将有生命危险，尤其要避免在温暖季节生食贝甲类海产品；开展创伤弧菌污染和感染现状调查，掌握创伤弧菌食物中毒发生的规律，为预防创伤弧菌食物中毒提供更有针对性的措施；加强对饮食单位的食品卫生管理，防止在加工经营海产品时的交叉污染。

5.3.20 霍利斯弧菌

5.3.20.1 食品卫生学意义

霍利斯弧菌（Vibrio hollisae）是广泛分布于海洋、海口和近海岸的重要致病菌，不仅有数量优势且毒力及感染力均占一定强势。20世纪80年代初期发现时原称肠道EF-13群弧菌，1982年经DNA杂交研究，被确认为另一个嗜盐病原性弧菌新种，主要引起人类腹泻，有的还有呕吐、发热。

本菌主要存在于沿海水中，食海产品与生牡蛎易染病，患者多为青年，其他还有蛤和小虾等水产品。它不仅可引起肠道感染，还可引起小鼠伤口感染。本病为自限性疾病，较重或有慢性原发病者，应积极用抗生素治疗。霍利斯弧菌虽然毒力略弱，但也可引起肠、肺、肝、肾脏组织细胞水肿、变性、白细胞渗出、聚集等，应引起足够的重视。

5.3.20.2 形态及染色特征

本菌为较细小的革兰阴性杆菌，稍呈弯曲，顶端有单根极端鞭毛，动力活泼。

5.3.20.3 生长要求和培养特性

在嗜盐琼脂平板上生长良好，18～24h长出1～2mm光滑、湿润的落。在TCBS琼脂上生长较差，37℃孵育18～24h菌落较小，蓝绿色，凸起。在S.S琼脂上，圆形、光滑、扁平淡灰色。在麦康凯琼脂上，针头大，光滑、圆形无色透明菌落。

5.3.20.4 生化特性

由于此菌不易在无盐营养肉汤、无盐胨水及常用的培养基中生长，给检验工作带来一定困难，应摸索一套适用于霍利斯弧菌分离培养、鉴定的常规方法，以减少工作失误。

已经证明的有：氧化酶、甲基红、硝酸盐、O-F+/-、动力、过氧化氢酶、靛基质、葡萄糖、甘露糖、L-阿拉伯糖、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶均为阳性，30g/L和60g/L氯化钠肉汤生长。

鸟氨酸、精氨酸、甘露醇、麦芽糖、乳糖、七叶苷均为阴性（表5-3-37）。

由于这类细菌在常用培养基上大多不生长，在常用的生化鉴定中生化特性不明显，往往出现判断错误。国内在这方面的报道也较少，与其他菌的生物化学差别参考表5-3-38。

5.3.20.5 抵抗力

本菌对氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那、链霉素、红霉素、复方磺胺制剂、多粘菌素均敏感。

5.3.20.6 致病性

其毒性因素主要是肠毒素。曾在患有慢性肝病患者的血液中检测到该菌，美国有多起食物中毒报道。主要的毒性是引起中毒胃肠炎，同时也能引起原发性败血症。

毒力试验：动物试验取11～14g小白鼠分为4组，每组2只，将含霍利斯弧菌10⁹/mL分别进行腹腔注射（0.1mL组，0.3mL组，0.5mL组），对照组硫酸镁肉汤0.5mL，注射霍利斯弧菌菌液后，全部试验组小白鼠8h开始发病，出现烦躁不安，发烧，呼吸急促等表现。0.1mL组、0.3mL组发病后4～6h逐渐好转，0.5mL组16h后全部死亡，对照组正常，死亡动物解剖后，皮下明显出血，心脏淤血，肝脾明显肿大，肠黏膜明显充血水肿，取肝组织作革兰氏染色及培养霍利斯弧菌，将0.1mL组、0.3mL组动物处死，肝组织未见此菌。

5.3.20.7 细菌学检验

本菌的检验程序同霍乱弧菌或副溶血性弧菌。

5.3.20.8 食品综合控制

充分烹调食品，保证杀死其中的污染菌体；避免交叉污染；冷冻只能使污染的菌体数量不再增加，但杀不死菌体。因此，冷冻后的加工必须严格，保证食品卫生安全。

5.3.21 溶藻弧菌

5.3.21.1 食品卫生学意义

溶藻弧菌（Vibro alginolyticus）是弧菌属中较晚被发现的一个种别，过去曾把它划归为副溶血性弧菌生物2型，现在认为是一个独立的菌种。大多数菌株来自创伤和接触海水后的感染伤口以及耳、眼部感染等。溶藻弧菌是一种有较强致病能力的弧菌，主要分布于海水和海产品中，可引起脓毒血症、人类创伤感染和败血症（图5-3-53），偶尔从急性肠炎病人粪便中检出。这种嗜盐菌曾认为对人无致病性，后发现其可引起人的败血症和创伤感染，纪舒萍等1989年首次证实其为食物中毒的病原菌。

溶藻弧菌属于条件致病菌，当菌量达到一定量时可以引起食物中毒。在夏秋季节该菌极易在盐分较高的食品中生长繁殖，2h后即可达到中毒菌量。7～10月是该菌造成食物中毒的高发季节。在有生食海产品史的人群中出现较多病人成批出现的特点，在人体内的潜伏期短为4～17h。中毒病人往往出现腹痛、水样便腹泻及呕吐的症状。

5.3.21.2 形态和染色特征

革兰氏染色阴性，两端极浓染的粗短杆菌。具鞭毛，无荚膜，无芽胞，小杆状，稍弯曲，运动活泼如穿梭样。兼性厌氧，S.S平板不生长，pH 6～10最适宜生长，3%～12%NaCl胨水生长，>14%NaCl胨水不生长，在氯化钠琼脂上呈无色半透明，挑之有黏丝。爬行试验阳性，神奈川现象阳性，产生耐热肠毒素。

5.3.21.3 生长要求和培养特性

在氯化钠琼脂平板上该菌菌落为黄色，圆形、隆起、光滑、湿润，直径2～3mm，略带黏性。经37℃18h培养后，在TCBS平板上出现黄色、直径2～3mm、圆形隆起、光滑湿润的菌落；室温放置2d后，黄色菌落变为绿色带黏性，血平板上出现溶血环；还可能出现圆形、呈蓝绿色、直径2～3mm的菌落，而副溶血性弧菌选择性琼脂平板上出现表面光滑、边缘整齐2～3mm的菌落。

5.3.21.4 生化特性

见表5-3-39。

5.3.21.5 抵抗力

治疗以敏感抗菌素及对症为主。溶藻弧菌分离株已经对洁霉素、乙酰螺旋霉素、万古霉素、氯洁霉素、制霉菌素完全耐药。对新霉素、四环素、强力霉素、麦迪霉素、奥复星、氯霉素、氟啶酸、呋喃妥因、淋必治、多粘菌素、复方新诺明、丙氟哌酸等等呈现中等程度耐药。

5.3.21.6 致病性

溶藻弧菌食物中毒的机理目前尚不十分明确，可能与溶藻弧菌能产生耐热肠毒素有关，病人恢复期血清抗体滴度可比发病初期明显增高，目前认为该菌引起食物中毒的机理，即是该溶血毒素所致。表现为脓毒血症、人类创伤感染和败血症，也能引起急性肠炎。几种弧菌的致病表现见表5-3-40。

5.3.21.7 细菌学检测

检测程序及方法同霍乱弧菌或河弧菌。

5.3.21.8 食品生产综合控制措施

生食或未煮透受溶藻弧菌污染的鱼虾贝类等海产品是引起这种弧菌性食物中毒的主要原因，有时也存在交叉污染的情况，因此，预防的关键在于建立良好的食品卫生观，海产品要煮熟煮透，还要避免交叉污染及细菌在食品内的繁殖。

5.3.22 嗜水气单胞菌

5.3.22.1 食品卫生学意义

在伯杰系统细菌学手册（1986）中，嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于气单胞菌科、气单胞菌属，分为有动力嗜温群和无动力嗜冷群。普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，对水产动物、畜禽和人类均有致病性，是一种典型人-兽-鱼共患病病原。可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻，往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失，已引起国内外水产界、兽医学界和医学界学者的高度重视。熟肉制品气单胞菌带菌率为39.6%，熟虾5%，淡菜为11.1%，从牛奶中也能分离出嗜水气单胞菌。淡水及淡水鱼体均可带染，与金鱼接触者或钓鱼者都可因外伤或咬伤而感染。北京和吉林都曾发生过嗜水气单胞菌食物中毒事件，吉林长春曾发生某高校因食用猪肉炒菜食物中毒的，经我们系统鉴定为嗜水气单胞菌。我国1984～2010年共报道食物中毒事件35起，占所有细菌性食物中毒事件比重为2.29%（居第10位）。

5.3.22.2 形态及染色特征

气单胞菌属属内明确的有14个种、1个未定种和7个其他培养物。气单胞菌可分为三个亚种：嗜水亚种（A. hydrophilasubsp.hydrphila），不产气亚种（A.hydrophilasubsp.anaerogenes），解胺亚种（A.hydrophilasubsp. proteolytica），前两种是赖氨酸脱羧酶阴性，后一种是赖氨酸脱羧酶阳性。明确的种为：嗜水气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌（A.allosaccharophila）、兽气单胞菌（A.bestiarum）、豚鼠气单胞菌、鳗鱼气单胞菌（A.encheleia）、嗜矿泉水气单胞菌（A.eucrenophila）、简氏气单胞菌（A.jandaei）、中间气单胞菌（A.media）、波氏气单胞菌（A.popoffii）、杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）、舒氏气单胞菌、温和气单胞菌、脆弱气单胞菌（A.trota）、维氏气单胞菌。杀鲑气单胞菌有5个亚种，维氏气单胞菌含有2个生物型。

该菌为革兰氏阴性、无芽胞、无荚膜或有薄荚膜的短杆菌，有时亦可呈双球状或丝状。单个或成对排列，长约0.5～1.0μm。极端单生鞭毛，有运动力，兼性厌氧，特殊培养条件下有荚膜产生（图5-3-54）。

5.3.22.3 生长要求和培养特性

需氧或兼性厌氧。4～45℃均能生长，最适生长温度为30℃，pH5.5～9。在6.5%NaCl中不生长，营养要求不高，在普通营养琼脂上即可生长，25℃培养48h菌落直径可达2～3mm，表面光滑、形成圆整、隆起、平滑、湿润的菌落，多数菌落可在普通营养琼脂培养基上产生浅黄色色素，少数菌落经4℃进一步培养后表现为淡红色。血琼脂平板上生长旺盛，部分菌株在10℃以下培养也可产生清晰β-溶血，形成灰白色、光滑、湿润、凸起、直径2mm的菌落，76%菌株有β-溶血环，3～5d后菌落成暗绿色。在肠道选择性培养基上形成乳糖不发酵菌落，较混浊，无臭味。在TCBS平板上不生长，使液体培养系均匀混浊。在麦康克培养基上生长良好，在弧菌选择培养基TCBS或在6%NaCl中不生长，对弧菌抑制剂O/129不敏感，多数不发酵乳糖。

嗜水气单胞菌及杀鲑气单胞菌与霍乱弧菌一样，存在所谓活的非可培养（viable but nonculturable，VBNC）状态，VBNC状态实际上是一种休眠状态，其菌体缩小成球状，耐低温及不良环境，接种培养基在常规培养条件下不生长。一旦温度回升及获得生长所需的营养条件，VBNC状态的细菌又可回复到正常状态，重新具有致病力。

空气中或5%CO₂中都能很好地生长，液体培养时溶解氧在7.5～10.0mg/L菌体生长良好；基本培养基中加入Ser时，合成培养基产生菌数最高，其次是Val、Trp、Ala和Phe，它们有较强的促进嗜水气单胞菌生长的能力；镁离子是嗜水气单胞菌生长的必需离子，低浓度铁离子对其生长有一定的促进作用，锌离子抑制其生长；培养的2～4h为生长停滞期，4～8h为生长加速期，8～24h达到对数生长期，28～48h为生长平台期，48～72h细菌逐渐老化。

5.3.22.4 生化特性

关键的生化指标为：葡萄糖产气，发酵甘露醇、蔗糖，利用阿拉伯糖，水解七叶苷/水杨苷，鸟氨酸脱羧酶阴性。如上述6项指标符合，则可初步判定为嗜水气单胞菌（表5-3-41）。

生化试验阳性的有：V-P试验，赖氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶，抗氨苄青霉素，硫代硫酸钠，硝酸盐还原，产生吲哚，明胶液化，产H₂S，氧化酶和触酶反应都为阳性，KCN中可生长；阴性的有：鸟氨酸脱羧酶，丙二酸钠，分解山梨醇，分解肌醇，分解鼠李糖，分解乳糖，分解棉子糖，分解侧金盏糖。

5.3.22.5 抵抗力

嗜水气单胞菌对50ppm（50×10^-6）的氯、过氧乙酸、西波林氯、1600ppm（1600×10^-6）的戊二醛敏感；对氨苄青霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、红霉素、内酰胺、萘啶酸、磷霉素、氯霉素、布妥霉素、氟喹喏酮等敏感。

5.3.22.6 致病性

气单胞菌有广泛的致病性，感染包括冷血动物在内的多种动物如鱼类、禽类及哺乳类，引致败血症或皮肤溃疡等局部感染，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌。在水温高的夏季可造成暴发流行。人类感染运动性气单胞菌引致急性胃肠炎等，目前在国外已将本菌纳入腹泻病原菌的常规检测范围，是食品卫生检验的对象。

① 毒素 普遍存在于水环境中的气单胞菌，并不都有致病性。愈来愈多的证据表明，具有毒力因子的菌株才有致病性。嗜水气单胞菌存在种内的不同菌株，其毒力表现又和水温及宿主种类、品种有密切关系。其毒力因子有3类，一是胞外产物，如蛋白酶类：弹性蛋白酶、酪素水解酶、明胶水解酶；酯酶类：碱性磷酸酯酶、酸性磷酸酯酶、酯酶、乙酰胆碱酯酶；其他酶类：亮氨酸芳香基酞胺酶、脂肪酶、β-葡糖苷酶、淀粉酶等等。二是黏附素，如S蛋白型菌毛、外膜蛋白、溶血毒素、细胞毒素、细胞兴奋肠毒素、溶细胞毒素、气溶素和bec毒素等。三是铁载体，如含铁细胞和皮肤坏死因子等。

② 外毒素（exotoxin）嗜水气气单胞菌产生的毒素为分子量5.2kDa左右的蛋白质，称为HEC毒素或气溶素（aerolysin），具有溶血性、细胞毒性及肠致病性，属于穿孔毒素。还报道了一些性质相近的毒素，应属于同一毒素家族。胞外蛋白酶主要有耐热的金属蛋白酶及不耐热的丝氨酸蛋白酶两种，前者分子量约5.4kDa，对EDTA敏感，但能耐受56℃30min。蛋白酶本身对组织可造成直接损伤，此外还能活化毒素前体，因此外毒素是最重要的毒力因子。

③ 胞外蛋白酶（Extracellular protease，ECPase） 

该酶属于热稳定蛋白酶（TSMP），根据其分子量将其命名为ECPase54。它的最适pH为7.5，对Vero细胞有毒性（1∶2稀释仍可使Vero细胞变圆），腹腔注射能致死小白鼠，是一种直接致病因子。关于嗜水气单胞菌所产生毒素与胞外酶的关系需要进一步研究。

④ 菌毛（fimbriae pili）病原菌感染的第一步，就是在合适宿主的特定组织细胞上定居而不被机体所清除，有利于细菌在体内增殖和发挥毒性作用。在定居过程中，菌毛作为一种主要的黏附素起着重要的作用，是病原菌的毒力因子之一。

⑤ 表层蛋白（S蛋白）及外膜蛋白（OMP）致病菌侵入机体后的定居和体内增殖，除与菌毛有关外，亦与细菌的表层结构有关。S蛋白由单一亚单位组成，亚单位的分子量50～52ku，具显著疏水性，自我组装在菌体最外层，具有抗吞噬、抗补体作用等，此外还证实对宿主细胞有黏附作用。S层覆盖了运动性气单胞菌的LPS侧链，而且S层的抗原型为数甚少。运动性气单胞菌的4型菌毛有单在和束状两类，只有血凝及细胞黏附作用，是公认的毒力因子，与大肠杆菌等的4型菌毛有一定程度的同源性。

⑥ 内毒素（endotoxin，LPS）与大多数革兰氏阴性菌的内毒素一样表现相似的毒性作用，如热原性、白细胞数目减少或增多、弥散性血管内凝血、神经症状及休克以致死亡等。

⑦ 铁载体 嗜水气单胞菌能产生苯盐类及羟基肟盐类两类铁载体，前者含有2，3-二羟基苯甲酸（2，3-DHB）及赖氨酸、甘氨酸、色氨酸/苯丙氨酸。分泌铁载体的菌体同时还产生相应的OMP条带，作为铁载体的受体。

嗜水气单胞菌有多种血清型，其毒力有差异，感染的形式可以呈急性败血症，也可以由皮肤破损后引起局部感染。局部感染不仅在抵抗力降低时向全身扩散，而且细菌在局部感染产生的外分泌物（外毒素、胞外酶等）可能被吸入血液，感染严重时细菌侵入血液，并在其中大量繁殖产生毒素，造成机体严重损害，引起败血症。

气单胞菌属的血清型极为复杂，每个基因型及表型包括多种O抗原。人源分离株常见的是O∶11、O∶34及O∶16，我国鱼源株主要有O∶9、O∶11型多见于动物和人的败血症及严重的创伤感染，O∶34型主要导致胃肠炎和败血症。钱冬（1995）研究了三十余株分离自暴发病鱼的嗜水气单胞菌的血清型，结果表明按O抗原的不同，这些菌株大部分可分为TPS-30和PBJS-76两个血清型，这两个血清型菌株有较强的产溶血素的能力，对健康白鲫有极强的毒力，可能是引发近年来暴发性鱼病嗜水气单胞菌的主要血清型。这一研究结果将有助于制备菌苗的菌种选择，为早期诊断和开展病原体检测提供了理论依据。

细胞毒肠毒素基因（Cytotoxic enterotoxin gene）：基因act是从腹泻分离株SSU中克隆测序发现该基因有一个大的ORF，约有1479bp。act基因能够编码54.5 ku 的蛋白质，该蛋白为细胞毒肠毒素（Act）的前体形式，并含有一段23个氨基酸的导肽。成熟的Act为52 ku的蛋白，并具有溶血性、细胞毒性、肠毒性。通过缺失分析鉴定了对于Act毒素的生物学活性的某些必需氨基酸，氨基酸245～274和361～405两个区域对生物功能是非常重要的。氨基酸245～274阻遏Act毒素的细胞毒活性，其中Tyr256、Trp270和Gly274是细胞毒活性的必需氨基酸；氨基酸361～405中Trp394和Trp396对生物活性十分重要。另外，他们对Act进行增产、纯化及作用机制的研究发现导致鼠回肠分泌液体的最小毒素量为200ng，静脉注射鼠的半致死量为27.5ng。证明毒素的作用机制与红细胞膜的膜孔相关，孔的直径1.14～2.8nm；氯化钙能够抑制毒素对红细胞的溶解，但不影响毒素与红细胞的结合及膜孔的容量；毒素与胆固醇结合，抑制了毒素在红细胞膜上形成孔的能力。

溶血毒素基因：迄今为止，人们至少已克隆了6种嗜水气单胞菌的溶血毒素基因，它们是Howar从Ah65菌株得到的气溶素基因，Aoki和Hiran从ATCC 7966得到的AHH1和AHH2基因，Hirano等从28SA菌株得到的AHH3和AHHd以及从AH-1菌株得到的AHH5基因。

5.3.22.7 细菌学检测

食物中毒的嗜水气单胞菌检验参考GB/T 18652—2002，如图5-3-55。

从患败血症动物的脏器分离嗜水气单胞菌，一般较少杂菌污染，可用血平板、麦康凯平板或TSA培养基等直接分离培养。从腹泻粪便中分离则需采用RS等选择培养基。亦可采用API 50E或API20E等检测试剂盒进行鉴定。分离株是否有致病性，则还需检测胞外蛋白酶等毒力因子，方法可用脱脂奶平板划线，或用相应抗体建立的ELISA试剂盒。

（1）采样与细菌分离 采集肝、肾等实质性器官或病变组织，无菌划线接种于普通琼脂平板，28℃培养24h；检测水样时先用加有0.2μm滤膜的灭菌塑料滤器过滤，后将滤膜加入装有碱性蛋白胨水的试管中，28℃培养24h，再划线接种于普通琼脂平板。检样若为待检菌株，可先用普通肉汤复苏，28℃培养24h，再划线接种于普通琼脂平板。

（2）形态学鉴定 观察普通琼脂平板上菌落形态，并作革兰氏染色、镜检。

（3）选择培养基鉴定 取纯培养物穿刺接种于AHM培养基，37℃培养24h。若为污染菌，可直接接种于RS培养基，37℃培养18～24h，观察结果。

（4）细菌学检测结果

① 形态学鉴定 嗜水气单胞菌是G-短杆菌，极端单鞭毛，有运动性、兼性需氧型、无芽胞、无荚膜。在普通琼脂平板上生长呈光滑、圆整透明菌落，无色或淡黄，有特殊气味，血平板上呈明显β溶血。

② 鉴别培养基检测 AHM培养基的Ah阳性检出率54.76%（46/84），RS培养基的Ah阳性检出率83.54%（66/79），两种方法检测符合率66.36%（71/107）。

嗜水气单胞菌重要的毒力因子有外毒素、蛋白酶及S蛋白，不同菌株毒力因子存在差异性，通过不同菌株对小鼠致死性试验，选择蛋白酶一项作为检测指标，具有代表性，同时简化了检验程序。蛋白酶（ECPase54）的DotELISA检测法比蛋白酶平板法灵敏度高。已知嗜水气单胞菌产生多种蛋白酶，用Dot-ELISA检出的仅ECPase54一种，而平板法可检出各种蛋白酶。两种方法具有互补性，同时使用可将Ah的蛋白酶检出率提高到84.68%（94/111）。

5.3.22.8 综合控制措施

嗜水气单胞菌能够引起水生动物疾病，水产品带染率比较高，因此，对水产品处理加工时要注意卫生安全，食用水产品要加热彻底。在其他食品如猪肉等也要注意生熟交叉污染，烹调时要加热彻底。

5.3.23 类志贺邻单胞菌

该菌的命名，主要是根据它与志贺氏菌具有共同抗原及类似腹泻感染的关系而定。1974年Bergey’s细菌鉴定手册第八版将该菌定名为“类志贺邻单胞菌”，属弧菌科；1980年又划归为肠杆菌科，邻单胞菌属内唯一的一个种。

5.3.23.1 食品卫生学意义

类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides，PS），是引起沿海城市、热带和亚热带地区散发性或流行性急性传染性腹泻和食物中毒的潜在病因之一，类志贺邻单胞菌具有一定的侵袭力，侵袭肠黏膜引起炎症反应和上皮细胞脱落，产生不同程度的腹泻。从Ferguson首次由病人粪便检出类志贺邻单胞菌以来，该菌引起的腹泻（偶尔导致新生儿的败血症、脑膜炎等）散见于世界各地。近几年发现由该菌引起的集体食物中毒有增多趋势，有的国家已将它规定为食物中毒病原菌，然而，由该菌引起腹泻的机制尚不清楚。该菌以污染的水和食物为途径经口感染，夏秋季发病较多，人群普遍易感（图5-3-56）。

淡水鱼、禽肉、畜肉以及被含本菌的淡水污染的海产品等是常被累及的食品。国外报道，淡水鱼带菌率为10.2%。国内报道，9种淡水鱼带菌率为44.1%，农贸市场鲢鱼为40%，鲫鱼为37.5%，草鱼为33.3%，猪肉为4.3%，鸭肉为20.9%，鸡肉为13.9%，海产品为8.4%。甲壳类、贝壳类海产品带菌率为12.1%。

人和动物的粪便携带本菌污染水源和环境，致使食品受到污染。腹泻病人的带菌率为1.7%～2.7%，观赏动物带菌率为28.2%。我国从1987～2006年共报道中毒事件8起，占所有细菌性食物中毒事件比0.52%（并列第16位）。

5.3.23.2 形态和染色特征

类志贺邻单胞菌革兰氏阴性、兼性厌氧杆菌，大小为3×（0.8～1.0）μm，呈单个排列，两端钝圆，呈单、双或短链状。属偏端丛毛菌，1～5根鞭毛，有动力。电镜下菌体表面有砌砖样组织结构，宽度不一，可能代表此菌的O抗原，无芽胞，微荚膜或胞外黏液物质。生存菌体中有包涵体样结构，可能是菌体处在不利条件时的产物。

5.3.23.3 生长要求和培养特性

本菌在选择性不强的S.S琼脂、麦康凯和改良DC琼脂平板上生长较佳，在30～41℃均能生长，最适生长温度为37℃。在各种肠道培养基上经37℃24h培养基本为不发酵乳糖、无色、扁平、湿润、半透明、边缘整齐、光滑、中等大小的菌落，1～1.5mm大小左右。挑取该菌落接种于克氏双糖铁料面（KIA）37℃培养24h后或延长培养时间（48h后），菌落斜面呈碱性反应，发红变大。该菌在麦康凯平板上形成圆形、隆起、无色半透明光滑菌落，大小中等；在S.S琼脂上菌落较小，似痢疾杆菌；改良DC琼脂上可形成扁平、湿润、光滑、圆整并带有同心圈蓝色菌落。在克氏双糖培养基上，底层产酸变黄不产气，有动力，斜面不变色，不产H₂S，此与志贺氏菌相似。做志贺氏菌多价血清凝集试验为阴性，氧化酶试验阳性。

类志贺邻单胞菌适宜pH值范围是6.4～10，最佳pH值为8.4。大多数菌可在以氨作唯一氮源，葡萄糖作唯一碳源的无机盐培养基上生长。

5.3.23.4 生化特性

本菌氧化酶、过氧化氢酶、甲基红、靛基质、硝酸盐、β-半乳糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶及精氨酸水解酶试验为阳性；发酵葡萄糖、麦芽糖、蕈糖、肌醇。不发酵甘露醇、甘露糖、棉子糖、鼠李糖、纤维双糖、木胶糖、阿拉伯胶糖、水杨素、山梨醇、卫矛醇、侧金盏花醇、丙二酸盐和枸橼酸盐，液化明胶、V-P试验、尿素酶、H₂S、苯丙氨酸脱氨酶及七叶苷试验等均为阴性；大多菌株对弧菌抑制剂O/129敏感；在6%氯化钠蛋白胨水中不生长（表5-3-42）。

5.3.23.5 抵抗力

药敏试验中本菌株对氯霉素、先锋霉素I、痢特灵、复方TMP、四环素为高度敏感，可作为治疗本菌感染的首选药物；对多粘菌素B、丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、链霉素较敏感；对红霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素耐药。

5.3.23.6 致病性

（1）动物试验 将分离菌接种肉汤，37℃培养18h，取培养物0.3mL、0.5mL分别注射于小白鼠腹腔，各3只为一组，以肉汤作对照。结果：注射0.3mL组，应于24h内全部死亡；注射0.5mL组，应于6d内全部死亡。两组解剖后均能分离到与接种菌相同的纯菌。注射肉汤对照的小白鼠应无异常反应。

（2）毒素 类志贺邻单胞菌菌体裂解后能释放出强烈的内毒素，是引起人体全身反应的因素，如发热、毒血症、休克以及大肠黏膜的血管收缩、缺血、坏死与溃疡等。类志贺邻单胞菌除内毒素外，尚可产生外毒素。有两种，即耐热性肠毒素（ST）与不耐热肠毒素（LT），用兔肠袢结扎实验和乳鼠饲喂试验验证毒素情况。近年研究证明，没能从菌体中克隆出肠毒素基因，因此推测类志贺邻单胞菌产生肠毒素是一种新的类型肠毒素。类志贺邻单胞菌的主要致病因素是侵袭力，通过侵袭力可直接侵入肠黏膜上皮细胞，并在其内生长繁殖。豚鼠与猴的模型实验及人志愿者证明，类志贺邻单胞菌不管有无肠毒素，只要具有侵袭肠黏膜上皮细胞能力者均可致病。当使用的菌株不同其毒力也不同，使用的动物和细胞敏感性不同或实脸方法上存在差异也导致耐热性及不耐热性肠毒素的实验室检测的结果不确定。

细胞溶素（cytolysins）：对Vero细胞、Y1细胞、Hep2细胞、INT407细胞及CHO细胞均表现较为强烈的细胞毒性。

溶血素（haemolysin）以前的试验对牛、马、羊、兔的红细胞琼脂平板不溶血，后来证明类志贺邻单胞菌溶血产生需要铁的存在，在铁存在情况下其人血平板能看到有溶血现象。

另外还产生弹性蛋白分解酶、与致病性有关的质粒、组胺、河豚毒素等毒性物质。

类志贺邻单胞菌能引起细胞机能障碍和坏死，其致病性具有下述特点：

① 具有光滑型脂多糖（LPS）体壁O抗原，是该菌与细胞相互作用因子，是具有毒力的标志，受质粒所控制。无毒株引入此质粒，可对上皮细胞产生侵袭性。

② 具有侵袭上皮细胞，并亦有在细胞内繁殖的能力。

③ 侵入细胞后能合成毒素。

（3）抗原构造 类志贺邻单胞菌具有菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，Shimada和Sakazaki（1978年）将类志贺邻单胞菌分成40种血清型，现在已经有102种O抗原和51种H抗原（2000年）。类志贺邻单胞菌与志贺氏菌之间有血清学交叉现象，“O”抗原分离菌均与鲍氏志贺氏菌多价3诊断血清凝集，与沙门氏菌O-F多价诊断血清不凝集。类志贺邻单胞菌O17与宋内氏志贺氏菌I相O抗原有交叉，类志贺邻单胞菌的O11∶H11，O22∶H3，O93∶H2与痢疾志贺氏菌8、7、6分别交叉；类志贺邻单胞菌O23∶H1a1c1与鲍氏志贺氏菌13型O54∶H2、鲍氏志贺氏菌2型O57∶H3及鲍氏志贺氏菌9型有交叉。另外，类志贺邻单胞菌某些菌株不仅与志贺氏菌有共同抗原，而且与侵袭性大肠杆菌间也存在抗原关系。因此在做细菌检验工作中不能单凭血清学结果对细菌作出鉴定，必须做具有特征性鉴别试验，方可确诊（图5-3-57）。

5.3.23.7 细菌学检测

细菌阳性率的高低与标本采取时机、培养技术及培养基质量等有密切关系。类志贺邻单胞菌阳性率国外一般在70%以上；国内则在20%～70%之间。粪便培养准确可靠，但细菌阳性检出率仍较低，培养时间较长，诊断血清经常受大肠埃希氏菌等的干扰，且不够简便，很难满足临床诊治及流行病学调查的需要。

近年来，国内外已先后采用荧光抗体染色法、玻片固相抗体吸附免疫荧光技术、对流免疫电泳法、粪便凝集试验等方法，均比较快速、简便，且敏感性较好。玻片固相抗体吸附免疫荧光法检测粪便标本具有快速（2h报结果）、经济、简便等优点，有利于流行病学调查及早期确诊；荧光菌球法可在8～12h内得出初步结果；增菌乳胶凝集法的阳性率可超过常规培养，直接乳胶凝集法阳性率略低，但简便快速；免疫染色法快速简便，全部操作可在1h内完成。国内单克隆抗体（McAb）建立的快速检测方法对类志贺邻单胞菌感染的快速诊断，具有较高的敏感性、特异性和快速性，实验程序简便，适合于医院及基层医疗单位，具有重要意义。

常规食品中类志贺邻单胞菌的检验类似河弧菌检验，分离出菌株后用类志贺邻单胞菌O1～O50及多价血清进行分型鉴定。同时可作小白鼠的动物试验，对动物有致病性。

5.3.23.8 综合控制措施

鸟类可远距离传播该菌，应注意防止食品被其污染。水产品的该菌污染率较高，食品加工、烹调时要注意加热彻底，防止食物中毒。腹泻病人分离率也较高，注意治疗和传播。

5.3.24 香港海鸥形菌

5.3.24.1 食品卫生学意义

香港海鸥形菌（Laribacter hongkongensis，gen.nov，sp.nov.，LH）于2001年在香港1名54岁肝硬化病人的血液和胸腔脓汁中首先分离到， 这种细菌可以导致人类发生严重的肠胃炎，属于新发现的菌种，香港海鸥形菌属为原核细菌（Proteobacteria）、奈瑟氏菌科（Neisseriaceae）细菌。香港海鸥形菌主要存在于淡水鱼的肠道内，目前发现香港海鸥形菌与社区性肠胃炎和旅行者腹泻相关，该菌在中国香港、大陆、瑞士、日本、非洲等地均已分离出，说明香港海鸥形菌在全球普遍存在。香港大学医学院感染及传染病研究中心发现：25%的淡水鱼和15%的加工过的新鲜鱼肉中，含有“香港海鸥形菌”。它是近20年来医学界发现的第一种可引致病人腹泻、甚至严重肠胃炎的新食源性病原菌。食用了未经煮熟的鱼类，容易感染此病菌。而预防感染的最佳方法，自然是将鱼类和加工过的鱼肉彻底煮熟后才进食。不要将未经煮熟的肉类及熟肉放在一起，以防止交叉感染。

对20位受“香港海鸥形菌”感染病人的调查结果显示：其中80%病人的腹泻排泄物呈水状，而另外20%的腹泻排泄物中则带血；最严重的病人每天腹泻的最高次数可达30次，最严重个案出现腹泻现象持续的时间长达90d。在对近期的17名病人调查时发现：他们之中有94% 曾在出现腹泻前3天内进食过鱼类；29%曾在出现腹泻其前3天内进食加工过的鱼肉；59% 曾外出旅游。

为初步了解中国鱼类产品中香港海鸥形菌的污染情况，2005年8～10月对广西、广东、福建、浙江和河北5个沿海省份的水产品批发市场、零售市场和饭店采集的鱼类产品进行了香港海鸥形菌的监测。在5省1097份鱼类样本中，草鱼247份、鲤鱼248份、其他淡水鱼431份和海水鱼171份。草鱼的检出率为7.69%（19/247），鲤鱼为0.81%（2/248），其他淡水鱼为0.23%（1/431），海水鱼中未检出（O/171）。河北省淡水鱼香港海鸥形菌的污染状况，采用API 20NE及VITEK全自动微生物分析系统进行鉴定，纸片法进行药敏实验。结果：340份淡水鱼中检出2株香港海鸥形菌，检出率为0.6%，其中草鱼的检出率为2.6%，其余鱼种未检出香港海鸥菌。

北京市40件草鱼样品进行香港海鸥菌的检测，检出香港海鸥菌7株，检出率为18%。污染包括鲩鱼、大鱼、鲮鱼、淡水黑鲈、桂花鲈及非洲鲫，发现两成五的淡水鱼及一成五的“鱼片粥”中含有“香港海鸥形菌”，更在六成鲩鱼、五成大鱼和三成鲮鱼中发现“香港海鸥形菌”。淡水鱼加工过程中避免交叉污染，食用时应加热煮熟，尽量不吃生的或加热不彻底的淡水鱼。

5.3.24.2 形态特征和染色特征

香港海鸥形菌属革兰氏染色阴性菌，为变形菌门（Proteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）的一个新属，两端生有鞭毛，菌体弯曲似海鸥状或螺旋杆状，大小为（0.79～2.5）μm×1μm。基因组大小为3Mb，16S-rRNA基因序列特征与目前已知细菌存在差异（图5-3-58）。

5.3.24.3 生长要求和培养特性

香港海鸥形菌是一种嗜温菌，对热和酸的抵抗力较强。该菌适合生长温度是25～42℃， 耐盐性在1%～2%环境生长， 但在含3%以上NaCl环境不能生长， 气体要求不明显，在5%CO₂环境中并未增强其生长。在<15℃和>42℃的条件下不能生长， 28℃是该菌比较适宜的生长温度；在pH5.0～9.5范围内可以生长， 最适生长pH值范围为5.5～6.0。

进行细菌培养时，在营养琼脂和CMA琼脂（麦康凯琼脂加32μg/mL 头孢哌酮钠）平板上呈灰白色半透明菌落，扁平状，边缘光滑整齐，直径在0.5～1.0mm之间的微小菌落。菌苔湿润不易挑取，打开平皿时有特殊腥味。

在选择性培养基上生长呈典型菌落；氧化酶、触酶同时阳性，且三糖铁阴性；经特异引物PCR检测为阳性的菌株，即可判定为LH菌株。

LH实验室诊断技术，包括表型诊断与基因诊断：制备SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂（MA）以及改良头孢哌酮MaeConkey琼脂（CMA）等6种培养基。SS、XLD、TCBS、1MA及CMA培养皿置37℃，48h，观察菌落形态，挑取可疑菌落继续鉴定。

培养皿置5%CO₂环境培养，42℃，48 h。 ① 挑选CMA琼脂选择性培养基上的典型菌落，加革兰染色阴性（筛选）； ② 3种简单的生化试验，即氧化酶、触酶与三糖铁试验（筛选）； ③ 特异性PCR检测。

5.3.24.4 生化特性

氧化酶阳性，触酶阳性，尿素酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，硝酸盐还原试验阳性；能够利用DL-羟基丁酸、己二酸、苹果酸和葵酸盐；壬二酸、葵二酸、辛二酸、丙酸、L-脯氨酸、L组氨酸、L-精氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖氨、乳糖，衣康酸、庚酸、柠檬酸、乙酸钠、肌醇、甘露醇、L-天冬氨酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、松三糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、木糖等为阴性。为典型的非发酵菌。鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、水解七叶灵、水解明胶、丙二酸钠、山梨醇、葡萄糖酸盐、苯乙酸阴性。

5.3.24.5 致病性

香港海鸥形菌食物中毒呈典型的腹泻症状，一旦感染香港海鸥形菌，病人均会发生腹泻，其中80%患者的腹泻呈水状，20%患者的排泄物中带血；严重的病人每天腹泻可达30次，腹泻持续的时间最长为90d。其他的致病性及流行病学资料目前还很有限，需要进一步研究。

5.3.24.6 抵抗力

加热灭活试验表明，香港海鸥形菌在65℃的肉汤中15min、在90℃的肉汤中5min、在100℃的肉汤中1min即可被灭活。

香港海鸥形菌对β-内酰胺类抗生素如氨苄西林、头孢噻酚、头孢他啶、万古霉素、链霉素、头孢曲松等耐药；对布妥霉素、亚胺培南、磺胺、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、多粘菌素B等敏感；复方新诺明中度敏感，从鱼类分离株对β-内酰胺类抗生素耐药情况较严重。

5.3.24.7 细菌学检验

采用CMA琼脂 、头孢哌酮血琼脂、SS、XLD、CCDA、TCBS作为分离培养基，以API 20NE鉴定系统鉴定结果作为确认依据，MM琼脂，氧化酶试剂，APPONE生化试纸条，NFC生化鉴定卡，药敏纸片。

24小时培养后，香港海鸥形菌在头孢哌酮血平皿上呈针尖大小、圆形突起微溶血的菌落，在头孢哌酮麦康凯琼脂几乎不生长。经40～48h在头孢哌酮血平皿上生长为浅绿色半透明光滑菌落，大小约1～2mm，不溶血；在CMA琼脂上菌落为无色半透明，菌落周围常有淡淡的黄色。涂片染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，形状呈海鸥状或S状。分离得到的菌株进行氧化酶、触酶、三糖铁反应试验，前两项阳性，后一项阴性。

以16S rRNA为扩增对象进行PCR方法检验，引物为：P1 5'-TTGAGGGTGCCGAACGGGA-3'，P2 5'-CTACCCACTTCTGGCGGATT-3'；反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃0.5min，72℃1min，35个循环，72℃5min。

5.3.24.8 控制

由于香港海鸥形菌主要存在于淡水水域和淡水鱼的肠道内，所以，人们应尽量避免喝生水；在吃鱼的时候，应该把鱼彻底加工、炖熟。一旦家中有人发生腹泻、呕吐，应及时到医院的肠道门诊就诊，不要擅自服用止泻药。香港海鸥形菌的治疗方法与一般细菌性胃肠炎相同。

5.3.25 弓形菌

5.3.25.1 食品卫生学意义

弓形菌（Arcobacterspp.）是一种人畜共患的食源性和水源性病原菌，与人类胃肠炎和菌血症有关，可危及老年人生命。目前关于弓形菌的公共卫生意义并不十分清楚，可能是一个独特的细菌，在动物、水、食品和环境中都能检出。形态上与空肠弯曲菌类似，而空肠弯曲菌能从宠物传染给人。Arcobacter引起胃肠炎的临床症状与弯曲杆菌病类似，主要表现为持续性腹泻，伴有腹痛、胃痉挛、恶心呕吐和发热等症状，但引起腹泻的频率和持久性比Campylobacter更高，且暂时性的感染率难以评估。也可以引起畜类的胃肠炎和流产。

弓形菌过去被称为类弯曲菌（Campylobacter-like），是一种与Campylobacter形态相似、亲缘关系很近的新型革兰氏阴性致病菌。Arcobacter属为弯曲菌科，该属有11个种常见布氏弓形菌（Arcobacter butzleri）、 嗜低温弓形菌（Arcobacter cryaerophilus）、食物弓形菌（Arcobacter cibarius）、硝化弓形菌（Arcobacter nitrofigilis）和斯氏弓形菌（Arcobacter skirrowii）五个致病种和其他非致病种组成，这五种菌能引起人和动物不同疾病。其中，前3种与人类和动物的腹泻、菌血症等疾病密切相关。Arcobacter广泛分布于自然界，致病力与弯曲菌相当，且比弯曲菌更易存活。该菌属能在有氧和低温下生长，经水和食品的粪—口途径传播。弓形菌作为人兽共患病病原及流行病学情况并不完全清楚，动物致病报告包括农场动物，如牛、猪、马、绵羊和鸡，引起流产、乳房炎和肠炎，肉也有污染。禽类被认为是最大的储存库，很多食物弓形菌就是从光鸡等中分离出。伴侣动物的调查资料较少，健康猫口腔布氏弓形菌和低温弓形菌检出率77%，狗50%，另一个调查为猫25%；猫粪中未见分离到，而其他的报告狗粪和口腔检出率分别为1.9%和0.7%。

该菌还大量存在于各种水体中，包括饮用水、湖泊水、地表水、地下水、污水等。它们可通过水体媒介进入人体肠道，引发一系列的肠道疾病，危害人类和动物的健康。研究结果表明弓形菌是城市污水和城市污水化学生物絮凝池活性污泥中的优势菌群，且具有致病性，极有可能成为水源性致病菌。艾明强等发现该菌为大庆油田过渡带文库的细菌群落的优势菌。Arcobacter感染人类的研究相对较少，Taylor等在泰国儿童的腹泻样本中分离到A.butzleri占全部菌株数量的2.4%。除A.butzleri外，也有从肺炎患者的尿液中分离到 A.cryaerophilus和从73岁的持续腹泻两个月的老人主动脉瓣膜上分离出A.skirrowii的文献报道。

5.3.25.2 形态特征和培养特性

Arcobacter菌体大小为（0.2～0.9）μm×（0.5～3）μm，为革兰氏阴性、无芽胞、无荚膜的弯曲短杆菌，通常呈S形或螺旋形，老培养物中出现球形、近似球形或疏松螺旋的丝状体，可长达20nm。一端或两端具有单鞭毛，运动活泼，可做“投标状”运动。该菌属能够在正常氧气浓度和厌氧环境下生长，但最适生长于微氧（3%～10%O₂）条件， 不需要H₂。最适生长温度为25～30℃ ，在37℃和42℃生长不定，4℃条件下不能生长（图5-3-59）。

5.3.25.3 生化特性

Arcobacter生化反应不活泼。乙酰甲基甲醇（V-P）试验和甲基红（MR）试验阴性，不发酵且不氧化糖类，能利用有机酸与氨基酸作为碳源，大多数菌株在0.032%甲基橙存在下可生长，可被0.1%氯化三苯基四氮唑（TTC）抑制，在1%牛胆汁，1%甘氨酸，1.5%（或3.5%）氯化钠及8%葡萄糖中生长不定。具有氧化酶和触酶活力，多数菌株具有过氧化氢酶活性，无脲酶活力。可还原硝酸盐为亚硝酸盐，吡嗪酰胺水解阴性，不水解明胶、酪蛋白、淀粉、马尿酸和酪氨酸，不产生吲哚和色素。在三糖铁（TSI）琼脂中不产生H₂S，分解半胱氨酸产H₂S情况不定。四种常见Arcobacter的主要特征差异见表5-3-43。

Arcobacter的系统发育分类 由于在食品安全上该属细菌属于较为新的菌类，这里简单介绍一下该属的分类。Arcobacter属DNA的G+C（摩尔分数）为27%～42%。按照细菌16S rRNA基因序列的系统发育相关性水平进行分群归类，β-变形菌纲下为弯曲菌目，弯曲菌目又可分为弯曲菌科，螺杆菌科和“Nautiliaceae”。弯曲菌科包括Amobacter属、Campylobacter属、硫磺单胞菌属（Sulfurospirillum）和暂未分类的Bacteroide sureolyticus。Arcobacter与弯曲菌科和螺杆菌科的其他细菌之间的系统发育关系见图5-3-60。

5.3.25.4 抵抗力

从肉鸡胴体分离的布氏弓形菌对如下抗菌药物敏感：丁胺卡那霉素、氨苄青霉素、恩氟沙星、达氟沙星、红霉素、四环素、吡哌酸、庆大霉素、呋喃妥英、土霉素、妥布霉素等。对如下药物具有抗性：羟氨苄青霉素、羟氨苄青霉素-克拉维酸、噻肟单酰胺菌素、头孢哌酮、头孢呋辛钠、氯霉素、头孢菌素、美洛西林、甲氯苯异恶唑青霉素、苯甲异恶唑青霉素、青霉素C、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲基异恶唑等。

5.3.25.5 致病性

Arcobacter是一种人畜共患的食源性和水源性病原菌，与人类胃肠炎和菌血症有关，可危及老年人生命。与畜类的胃肠炎和流产有关。Arcobacter引起胃肠炎的临床症状与弯曲杆菌病类似，主要表现为持续性腹泻，伴有腹痛、胃痉挛、恶心呕吐和发热等症状，但引起腹泻的频率和持久性比Campylobacter更高，且暂时性的感染率难以评估。

目前，国内尚未发现Arcobacter致病机理和潜在毒力因子相关报道，国外此方面报道也很少，实验研究主要集中在两方面：① 对Vero和CHO细胞的细胞兴奋型肠毒素、细胞毒素型肠毒素和细胞致死性分析研究；②对HeLa和Intestine 407细胞的黏附、定植能力测试。实验结果表明分离自环境、食品、动物和人体的A.cryaerophilus、A.butzleri和A.skirrowii均显示出不同程度的致病性表型，某些菌株可能具有潜在的毒力。

5.3.25.6 细菌学检验

（1）传统分离培养 Arcobacter培养要求相对较高，分离时，通常需在选择性培养基中加入血液或血清，同时加入多种抗生素，将温度控制在24～30℃，以抑制肠道正常菌群，提高分离方法的选择性。自1977年Ellis等首次建立了该菌属的分离方法以来，现已建立了多种不同的增菌、选择性平板和纤维素膜过滤的方法，主要归结为两大类：一步法和两步法。一步法是指直接使用选择性培养基进行分离培养，这类培养基主要有CIN（cefsulodinirgasan novobiocin）琼脂、 CAT（Cefoperazone amphotericin teicoplanin）琼脂、Skirrow琼脂、Butzler培养基、Campy-BAP培养基和mCCD（modified charcoal cefoperazone deoxycholate）琼脂等。两步法是指先使用液体增菌培养基进行富集培养，然后再利用固体选择性培养基或纤维素膜的方法进行分离培养。用于增菌的液体培养基主要有AB（Arcobacter broth）、ASB（Arcobacterselective broth）、AEB（Arcobacterenrichment broth）和CAT broth等。研究表明，与一步法相比，采用两步法可以提高Arcobacter的分离率。此外，虽然弓形菌在mCCDA和CAT培养基上均可生长，但与mCCDA相比，CAT可以更好地支持Arcobacter属中更多种的生长。

（2）分子鉴定与分型 传统分离鉴定方法存在步骤复杂和检测周期长等诸多不足。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，越来越多快速、特异性检测Arcobacter的方法应运而生，其主要代表是PCR方法。以16S rRNA和23S rRNA为靶基因的多重PCR方法已经成功应用于多种Arcobacter的同时检测。Kabeya等基于Arcobacter23SrRNA建立多重PCR方法，可同时鉴定A.butzleri、A.cryaerophilus1A、A.cryaerophilus1B和A.skirrorwii，弥补了所有表型、生化方法均无法鉴别A.cryaerophilus两个组的缺陷。全细胞蛋白的SDS-PAGE方法也被用于鉴定Arcobacter属，并成功鉴别并弥补法国生物梅里埃弯曲杆菌鉴定系统所不能区别A.butzerli和空肠弯曲菌的不足。

核糖体分型已被证明是鉴定Arcobacter的可靠和重要技术手段，但在实验室推广应用受到两个因素制约，首先是实验步骤需要根据样本情况进行细致优化；其次，分型操作涉及危险化学品或放射性同位素。目前已开发了采用胍抽提DNA法和与非放射性地高辛标记探针杂交的核糖体分型方法。使用PvulI或CI消化基因组DNA 的16S rRNA探针杂交可以鉴别Campylobacter、Helicobacter和Arcobacter3个属，或是Arcobacter属内的不同种。

5.3.25.7 防控措施

Arcobacter感染的途径可能包括人对人（宿主对宿主）的直接接触、食入被污染的饮用水或食物，其中家禽产品的污染率极高，此外，未经杀菌处理的奶类制品也是造成Arcobacter传播至人类的重要途径之一。因此，在预防控制Arcobacter引发人类疾病的措施上，建议从消灭或减少食物链中Arcobacter入手。在屠宰线上屠体受到的污染危害与牲畜粪便中携带的食源性致病菌密切相关。为了减少人畜共患病对消费者健康的潜在风险，在肉类生产过程中保证屠宰卫生，避免各种污染源对屠体的污染是至关重要的。在日常生产加工中，应依据HACCP原则，建立“过程控制”和定期微生物监测系统，加强对动物性食品加工过程中重点环节的监督管理，加大监测力度，及时掌握食品的动态卫生质量。

采取以预防为主的手段也是非常必要的，如加强食品生产经营单位以及从业人员的卫生知识的培训，推行持证上岗制度；加工从业人员应注意个人卫生，完善并执行卫生管理制度；加强食品卫生知识宣传，提高群众的卫生安全意识；实施良好生产规范守则等。

同其他致病菌相似，柠檬酸和乳酸可以抑制Arcobacter的生长繁殖，乳酸链球菌素可杀死Arcobacter。磷酸三钠和EDTA（单独或与乳酸链球菌素结合）作为一种短期控制手段，对杀灭Arcobacter纯培养物具有一定效果。需要注意的是，尽管Arcobacter与Campylobacter有很多相似点， 目前也有许多杀灭和抑制Campylobacter的方法，但有些方法对控制Arcobacter的效果却不太理想。例如，A.butzleri相比C.jejuni对辐照处理和低温的耐受性更强等。

5.3.26 克雷伯氏菌

5.3.26.1 食品卫生学意义

克雷伯氏菌属（Klebsiella）为肠杆菌科菌种，本属中肺炎克雷伯氏菌（又称肺炎杆菌，K.pneumoniae）、产酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）、臭鼻克雷伯氏菌（K.ozaenae）和鼻硬结克雷伯氏菌（K.rhinoscleromatis）与人类关系密切。产酸克雷伯氏菌是抗生素相关性出血性结肠炎的一种病原体。肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌在自然界的水、土壤中广泛存在， 是人和动物肠道及呼吸道的常居菌， 临床常见的条件致病菌，其中尤以肺炎克雷伯氏菌最为重要，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95%以上。肺炎克雷伯氏菌为呼吸道感染的重要病原体，常引起重症肺炎，还可引起泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。感染多发生于住院的衰弱患者。病原体往往从上呼吸道吸入，或通过污染的人工呼吸器、雾化器或各种导管侵入人体，医务人员的双手在交叉感染中亦起重要作用。因细菌常对多种抗生素耐药，故本病预后较差，病死率高（严重病例达50%）。

肺炎克雷伯氏菌还可通过不同食品如冰淇淋引起人食物中毒；产酸克雷伯氏菌也可以引起食物中毒。我国从1998～2011年共有8起食物中毒报道事件，占总细菌性食物中毒事件的0.52%（并列第16位）。1998年7月在济南某酒店开会人员因食用草莓冰淇淋而发生一起64人的集体性肺炎克雷伯氏菌引起的食物中毒，参加会议人员455人，患者出现腹痛、腹泻，少数病人伴有低烧。病人平均潜伏期11h，均有腹痛、腹泻、稀水样便，8例病人出现低烧，5例病人出现轻度脱水症状。病程最短2h，最长24h，无一例死亡。2006年北京宣武区一食堂15人就餐8人中毒，潜伏期33～46h，表现腹痛、腹泻、呕吐等典型食物中毒症状。累及食品包括酱肘花、四川泡菜、糯米藕、鳜鱼；病原为肺炎克雷伯氏菌。2001年沈阳一食堂发生15例因吃生炒鸡块引起产酸克雷伯氏菌中毒，4～24h后表现恶心、呕吐、发热，阵发性下腹部绞痛等症状。

5.3.26.2 形态特征和培养特性

属肠杆菌科，为革兰氏染色阴性的粗短杆菌。单个或呈短链，大小（0.5～0.8）μm×（1～2）μm或者2～5μm，单独、成双或短链状排列。不运动，有明显荚膜，多数有菌毛，无鞭毛，无芽胞。

营养要求不高，在普通琼脂培养基上形成较大的灰白色黏液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。在SS、EMB平板上可见发酵乳糖的淡红色、2～4mm 大小黏液型菌落， 厚实突起。在血平板上可见2～3mm 大小灰白色凸起黏液型菌落， 不溶血。在TCBS 平板上可见2～3mm大小的黄色菌落， 厚实凸起黏液型菌落。在这些培养基上用接种针挑起均有长丝状细丝出现（图5-3-61）。

5.3.26.3 生化特性

产酸克雷伯氏菌能分解葡萄糖、乳搪、蔗糖等， 产酸产气，氧化酶、H₂S、苯丙氨酸、鸟氨酸脱羧酶、明胶液化和DNA酶阴性；葡萄糖酸盐、靛基质、枸橼酸盐、MR、V-P、赖氨酸脱羧酶、尿素酶、肌醇、甘露醇、麦芽糖、木糖、ONPG、棉子糖等阳性。

与肠杆菌科其他细菌一样，具O抗原和K抗原（即菌体抗原和荚膜抗原），后者可进一步用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型，肺炎克雷伯氏菌属3型和12型；臭鼻克雷伯氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克雷伯氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。

5.3.26.4 致病性

克雷伯氏菌对外界抵抗力强，对多数抗生素易产生耐药性。在健康人的呼吸道和肠道正常菌丛中、自然界水和谷物中均能分离到克雷伯氏菌。本属细菌55℃ 30min被杀死，在培养基上可存活数周至数月。产酸克雷伯氏菌对庆大霉素、呋喃新、头孢哌酮、环丙沙星、诺氟沙星、氯霉素、阿米卡星、头孢唑啉等药物敏感，对氨苄青霉素耐药。能分解环境中的氰化物释放氨而解毒。

用12～16h肉汤培养物，5只小白鼠腹腔注射0.5mL，5只小白鼠胃饲0.5mL；用同剂量的灭菌肉汤分设对照组饲喂小白鼠。4h后注射组小白鼠精神倦怠，活动减少，继而出现卷缩、震颤、竖毛，伴有粪便变软、粘连成团等症状。胃饲组6h后应该出现注射组同样反应，无死亡，24h后逐渐恢复。对照组应该没有任何异常。病人平均潜伏期11h，均有腹痛、腹泻、稀水样便，低烧，轻度脱水症状，还有头痛， 肌肉酸痛、尿频等症状，发热。

5.3.26.5 抵抗力

在哺乳动物和昆虫中存在，在人易于存在于结肠和咽喉黏膜出及皮肤上，当然也会存在于人体的任何部位。

5.3.26.6 细菌学检验

检验方法按GB/T 4789—2003方法进行：将检样直接划线拌种于SS、EMB、TCBS、血平板36℃ 24h培养，观察菌落形态；同时， 将剩余食物和肛拭再分别用SC增菌液、GN 增菌液、肠道菌增菌肉汤、氯化钠结晶紫增菌液、7.5%氯化钠肉汤增菌液等培养基增菌，增菌后， 再划线于上述琼脂平板上， 36℃ 24h 培养后观察菌落形态。乳粉中克雷伯氏菌的PCR方法能够准确鉴定该菌。

5.3.27 柠檬酸杆菌

柠檬酸杆菌属（Citrobacter）为肠杆菌科成员。柠檬酸杆菌原译作枸橼酸杆菌，因枸橼酸是日本字，在化学品中已改作柠檬酸，故枸橼酸杆菌应改作柠檬酸杆菌。柠檬酸杆菌属具有致病意义的包括弗氏柠檬酸杆菌（C.freundii）、布氏柠檬酸杆菌（C.braakii）和科泽氏柠檬酸杆菌（C.koseri）。柠檬酸杆菌属是肠道细菌中常见的非致病菌（在机体抵抗力降低时偶尔致病），由于该菌与肠道中重要的致病菌沙门氏菌十分相似，故在肠道细菌的分类鉴定中非常重要。

5.3.27.1 食品卫生学意义

我国1986～2011年共有10起食物中毒事件，在所有细菌性食物中毒事件的构成比为0.65%（居第14位），主要涉及弗氏柠檬酸杆菌和布氏柠檬酸杆菌。潜伏期最短0.5h，表现有腹泻，恶心，呕吐，发热，头痛，抽搐，四肢麻木等。2000年深圳在2位患者的肛拭子及1份食品（凉拌三丝）样品中均检出弗氏柠檬酸杆菌，2008年哈尔滨因涮羊肉导致5人中的4人发病，因布氏柠檬酸杆菌引起。累及食品包括炒羊肉、熟鸡蛋、猪肉、凉拌菜、海蛎包子、米饭等。

5.3.27.2 形态特征与培养特性

柠檬酸杆菌为直杆菌，长2.0～6.0μm，单个和成对存在，革兰氏阴性，一般不产生荚膜。通常以周生鞭毛运动。兼性厌氧，有呼吸和发酵两种类型的代谢。在普通肉胨琼脂上的菌落一般直径2～4mm，光滑、低凸、湿润、半透明或不透明，灰色，表面有光泽，边缘整齐，偶尔可见黏液或粗糙型。

5.3.27.3 生化特性

氧化酶阴性，接触酶阳性。化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为惟一碳源。硝酸盐还原为亚硝酸盐，没有赖氨酸脱羧酶，不产生苯丙氨酸脱氨酶、明胶酶、脂肪酶和DNA酶。不分解藻朊酸盐和果胶酸盐，发酵葡萄糖产酸产气。分解L-阿拉伯糖、纤维二糖、甘油、麦芽糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-山梨糖、海藻糖和D-木糖等滩水化合物。甲基红试验阳性，VP试验阳性。DNA中G+C mol%为50～52（Tm）。柠檬酸杆菌可通过合成磷酸盐来吸收铀，体内的铀含量可以达到周围环境的300倍。

该菌的抗原体系包括32个O群抗原和87个H抗原。Sedlak与Slajsova（1966，1967）和Sedlak（1974）增加了O抗原和H抗原，O抗原的总数增至42个，而H抗原超过90个，进一步扩充了抗原体系。费氏柠檬酸杆菌中许多血清变型的抗原与许多沙门氏菌属和埃希氏菌菌株的抗原有关。从澳洲白蚁的后肠和造纸厂水中分离出的费氏柠檬酸杆菌，其中一些菌株在厌氧条件下可固氮（表5-3-44）。

5.3.27.4 抵抗力

见于人和动物的粪便，是很多动物和人的正常肠道栖居菌。时常作为条件致病菌分离自临床样品。也见于土壤、水、污水和食物中。 对哌拉西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢呋辛、复方磺胺甲恶唑耐药率超过50%；对亚胺培南、阿米卡星、头孢吡肟敏感。

5.3.27.5 致病性

柠檬酸杆菌在我国儿童腹泻检出率7.2%，对人感染，主要引起某些组织器官或系统（尤其是尿道及呼吸道系统）的炎性感染，也可导致败血症。还可引起脑膜炎、脊髓炎、中耳炎、心内膜炎等。食物中毒呈现典型的胃肠道症状，腹泻、腹痛、呕吐、发热等。对动物如河蟹、鳖、红螯螯虾、鲤等的感染，发病率和死亡率都很高，口腔溃疡等。

5.3.27.6 细菌学检验

常规细菌分离鉴定。用普通琼脂或肠道菌选择培养基分离，37℃培养24h，挑取可疑菌落做生化鉴定。也可用16S rDNA基因序列测定对柠檬酸杆菌进行鉴定。

5.3.28 爱德华氏菌

爱德华氏菌（Edwardsiella）属于肠杆菌科，爱德华氏菌属包括迟钝爱德华氏菌（E.tarda）、鲇鱼爱德华氏菌（E.ictaluri）和保科爱德华氏菌（E.hoshinae）三个种，其中迟钝爱德华氏菌是一种人兽共患病原菌，也是条件致病菌。迟钝爱德华氏菌又称迟缓爱德华氏菌或缓慢爱德华氏菌，是爱德华氏菌属细菌家族中较早发现的成员之一，该菌是爱德华氏菌属的模式种。

5.3.28.1 食品卫生学意义

我国2003年仅发生一起食物中毒事件，属于条件致病菌。在列车上因吃荷包蛋和烧鸭污染迟钝爱德华氏菌引起，潜伏期2～9h，表现腹痛，腹泻（水样便），恶心，呕吐，低热，头晕，呼吸困难等。人的其他感染包括败血症、脓肿、脑膜炎、心膜炎、各种感染等，从人的粪便中也能分离出来。

5.3.28.2 形态特征与培养特性

爱德华氏菌为短杆状或小直杆菌，大小为（0.5～1）μm×（1～3）μm，具周鞭毛，有动力，革兰氏染色阴性。兼性厌氧，繁殖温度为15～42℃，最适温度为31℃左右，在含盐0～4%的范围内均能生长，pH值5.5～9.0。鲇鱼爱德华氏菌喜欢较低的温度。

迟钝爱德华氏菌无荚膜和芽胞，4～10℃能够生长，最适生长温度25～32℃，42℃以上不生长，pH值范围5.5～9.0。在不同琼脂平板上发育缓慢，可在营养琼脂培养基上培养。在血琼脂平板上能在菌落周围形成狭窄的β型溶血环，在麦康凯琼脂、胆盐硫化氢乳糖琼脂（DHL）、SS琼脂等肠道菌选择性培养基上可形成较小菌落，因其产生 H₂S能使菌落中央为黑色。在亚硫酸铋琼脂（BSA）培养基上形成灰色、带棕色光晕和金属光泽的菌落。在胰胨大豆琼脂（TSA）培养基上可形成圆形、光滑、湿润、半透明的灰白色小菌落。在乳糖胆盐（LB）培养基上也能很好的生长（图5-3-62）。

5.3.28.3 生化特性

发酵D-葡萄糖及其他一些碳水化合物产酸产气，但与肠杆菌科中大多数其他种类相比其活性差得多； 氧化酶阴性，接触酶阳性，赖氨酸及鸟氨酸脱羧酶阳性，还原硝酸盐为亚硝酸盐，发酵麦芽糖和D-甘露糖。迟钝爱德华氏菌为模式株，ATCC15947（DSM 30052），DNA中G+Cmol%为55～58（Tm、Bd）。

5.3.28.4 抵抗力

常分离于冷血动物肠道及其他环境、尤其是淡水中，在温血动物和人也可被分离到。分布于中国沿海室内工厂化养殖场和网箱养殖区，日本也有分布。对氨苄青霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氟哌酸、卡那霉素、氯霉素、土霉素、四环素、红霉素、痢特灵、强力霉素敏感。

5.3.28.5 致病性

爱德华氏菌宿主范围很广，养殖鲻鱼、鲷鱼、牙鲆、狮鱼等均可被感染；淡水养殖的鳗鱺、斑点叉尾鮰、罗非鱼等也能被感染。对鳗鲡、鲇鱼和其他动物致病，Regalla（1982）还报道了由该菌引起的海豹的发病。流行季节为夏季和秋初高温期。迟钝爱德华氏菌已经在二十多种鱼类中引起了病害，包括淡水鱼类和海水鱼类，如鳗鲡（Anguilla japanica）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、真鲷（Pagyrus major）、虹鳟（Ocorhynchus mykiss）、罗非鱼（Tilapia nilotica）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）等。除此外，该菌还可感染两栖类动物如牛蛙（Rana catesbeiana）和爬行类动物如中华鳖（Trionyxsinensis）等。随受感染鱼的不同病状有差别，鳞鱼生病时，腹部及两侧发生大面积溃疡，溃疡的边缘出血，放出强烈的恶臭味，腹腔内充满气体使腹部膨胀。牙鲆患此病时，摄食量下降，腹部膨胀，解剖病鱼内有鸡蛋清样腹水，肾脏肿大，并有许多小白点。助齿鲷、真鲷，皮肤发生出血性溃烂，脾、肾上有许多小白点。

对人属罕见的机会致病菌，但如果不及时治疗会有生命危险。妇科感染引起新生儿生产过程感染多见，在妇女的生殖道能够分离到该菌，可能是孕妇接触污染水源而感染。2003年以来已经有超过300例感染迟钝爱德华氏菌，其中约83%表现胃肠炎症状。迟缓爱德华氏菌作用的靶器官主要是肝脏和肾脏。

（1）黏附和侵袭 鞭毛作为一种黏附素，协助细菌黏附到细胞表面，并通过诱发微丝重排而侵入到细胞内部。致病相关因子：血溶素、溶血素、铁载体、黏附素和侵袭素等，细胞外产物和菌体成分均含有毒素。

通过口腔灌注、 肌肉注射和腹腔注射等方法均可使牙鲆感染迟缓爱德华氏菌， 说明其可以通过食物和体表的伤口多种途径感染。

（2）分泌毒素 Ullah Arai发现迟钝爱德华氏菌中含有两种外毒素，它们可引起兔皮肤红斑和兔浮肿及溃疡性红斑；Chung发现对磷脂酞乙酰胺、磷脂酞胆碱和鞘磷脂有特异活性的外毒素；葛艳等发现迟钝爱德华菌的外毒素能致HEp-2细胞产生病变，变圆，脱落等（图5-3-63）。

5.3.28.6 细菌学检验通过分离培养、形态特征检查、生理生化特性检查对迟钝爱德华氏菌进行初步检验与鉴定。然后以血清进行分型，以PCR方法进行鉴定，也可以用16S rRNA进行鉴定。

间接荧光抗体技术：应用荧光标记的二抗，通过与第一抗体结合而检测未知抗原。抗迟钝爱德华菌的单克隆抗体建立起免疫组织化学的酶染色检验方法FITC（异硫氰酸荧光素）标记兔抗迟钝爱德华菌抗体，以此标记的抗体检测菌体。

5.3.29 哈夫尼亚菌

哈夫尼菌属（Hafnia）为肠杆菌科成员，其中的蜂房哈夫尼（H.alvei）是人的条件致病菌，能够引起家畜禽、鱼类等的感染。

5.3.29.1 食品卫生学意义

我国1995年发生一起食物感染性病例。临床上偶可引起人的泌尿道感染、呼吸道感染、小儿化脓性脑膜炎和败血症；也是人类肠道病原菌，可以引起溶血性尿毒综合征，曾发生一起小儿尿道感染和脓毒败血症。近年来我国从肠炎、败血症、化脓性脑膜炎、眼内炎等病例及化脓性血液、腹腔积液等临床材料检出蜂房哈夫尼菌。西班牙、意大利都发生过养禽业鸡只发病，表现无食欲、产蛋下降，腹泻，暴发性败血症等，致死率20.7%。

从哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼、土壤、废物、水、食品中能够分离到。动物胃肠道、特别是哺乳动物胃肠道是常在菌。澳大利亚从有袋类食肉动物、啮齿类动物分离较多，从公园小路的动物粪便、熊粪、鸟都分离到该菌。真空包装牛肉、猪肉、碎牛肉、零售牛肉、乳、冰淇淋（14%）、肉沫样品（34%）、鲜鱼（12%）和鸟类（3%～16%）都分离到。干酪和蜂蜜也能检出。爬行动物中的蛇、蜥蜴，无脊椎动物、昆虫、蝙蝠等都分离到。有些从青花鱼科水产品能够检测组胺产生，是否与鲭科鱼（scombroid）中毒有关现在并不知道。

5.3.29.2 形态特征与培养特性

直杆状，长2.5～5.0μm，无荚膜，无芽胞，革兰氏阴性。30℃时周生鞭毛运动，但可能出现不运动的菌株。兼性厌氧，有呼吸和发酵两种类型的代谢。在一般培养基上容易生长，在营养琼脂上的菌落直径一般是2～4mm，形态呈光滑、潮湿、半透明、灰色、表面光泽、边缘整齐。

5.3.29.3 生化特性

氧化酶阴性，接触酶阳性，化能有机营养。大部分菌株利用柠檬酸盐、醋酸盐和丙二酸盐作为惟一碳源（接种3～4天后）。还原硝酸盐为亚硝酸盐。在Kligle铁琼脂的高层中不产生H₂S。不产生明胶酶，脂肪酶和DNA酶。不利用藻朊酸盐，不分解果胶酸盐，不产生苯丙氨酸脱氨酶，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验阳性，但精氨酸双水解酶试验阴性。发酵葡萄糖产酸产气，不从D-山梨醇、棉籽糖、蜜二糖、D-阿东醇和间-肌醇产酸。MR试验35℃阳性，22℃则是阴性。通常在22～28℃由葡萄糖产生乙酰甲基甲醇，但在35℃ 时不产生。 DNA的G+C mol%为48～49（Tm，Bd）。有68个O抗原群和34个H抗原，O抗原可以分为O1～O7。与沙门氏菌有交叉凝集现象。

5.3.29.4 抵抗力

分布在人和动物包括鸟类的粪便，也分布在污水、土壤、水和乳制品中。蜂房哈夫尼亚菌对卡那霉素、丁胺卡那霉素及氯霉素、庆大霉素高敏；对青霉素、苯唑青霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、红霉素、洁霉素耐药。

5.3.29.5 致病性

对人偶然感染。对动物可引起鸡和鱼类感染，鸡感染时表现食欲减退，产蛋率下降，卡他性肠炎，败血症等；牛乳房炎。引起虹鳟鱼、马苏大马哈鱼、石斑鱼等的感染和死亡。在人的61例患者中共分离出80株蜂房哈夫尼菌，主要从呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道、皮肤和导尿管中分离出来，93.4%表现有临床症状（图5-3-64）。

5.3.29.6 细菌学检验

参考国家食品卫生检验标准GB/T 4789—2008方法进行。常规分离培养，快速生化鉴定，血清学鉴定，用O和H抗原血清进行鉴定。也可以用16S rRNA或PCR方法鉴定。