1.1.2 ELISA实验准备

1．酶标抗体的制备

常用的酶标抗体可通过在生物试剂公司购买得到。如需制备酶标抗体，则需根据实验需要选择适宜的酶及标记方法。

目前常用于标记的酶有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）、β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）、葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase, GOD）、酸性磷酸酶等。其中HRP和AKP最为常用。HRP的作用底物为H2O2，在适宜pH及供氢体（即色原底物，如OPD、TMB及ABTS等）存在的情况下，可发生迅速而专一的显色反应，如使用OPD，则显橘黄色，TMB显黄色，ABTS显蓝绿色。AKP是通过催化磷酸酯水解释放出无机磷酸而显色，或通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，然后在还原剂的作用下对生成的蓝色终产物进行测定。

2．固相载体的选择

目前大多数实验室中最常用的固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板，该材料具有价格低廉、蛋白吸附力强、操作简便等优点。另外，还可选择纤维素、交联右旋糖苷、聚丙烯酰胺等材料制成的酶标板。

3．抗原或抗体的包被

通常抗原或抗体通过物理吸附作用被结合在固相载体上。目前常用的包被条件如下：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液（例如，15mmol/L Na2CO3, 35mmol/L NaHCO3, 0.1% NaN3）将抗原或抗体稀释至1～100μg/mL, 4 ℃湿盒中包被过夜或37 ℃湿盒中包被3h。

4．ELISA清洗液的配制

通常使用的ELISA清洗液为PBS-T缓冲液，即1×PBS（pH 7.2）-Tween20（体积分数0.05%）。

5．ELISA实验结果的判定及表示方法

ELISA实验可通过目测法完成结果的定性判定，进一步可通过酶标仪测定光吸收值，以OD值表示定量结果。可先用梯度浓度的标准待测抗原的OD值绘制标准曲线，可由标准曲线方程计算得到未知样品中待测抗原的浓度。

例如，使用IL-17（白细胞介素-17）ELISA试剂盒检测人血液样品中IL-17的含量，测定前用IL-17标准品蛋白进行ELISA测定后，用OD值绘制的标准曲线如图1-4所示。

图1-4 ELISA样品测定前需要绘制的标准曲线