1.1.3 ELISA实验方法举例——间接法测定抗体
1.实验仪器、耗材及试剂
①经纯化的已知抗原。
②待测抗体溶液。
③HRP标记的二抗。
④包被液(配方可参考前文“抗原或抗体的包被”)。
⑤ELISA清洗液(配方可参考前文“ELISA清洗液的配制”)。
⑥封闭液:10%小牛血清或2% BSA/PBS-T(BSA即牛血清白蛋白)。
⑦底物缓冲液:pH 6.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液(Na2HPO456.77g、柠檬酸5.6g,加水800mL溶解,定容至1000mL, 4 ℃保存)。
⑧终止液:2mol/L H2SO4。
⑨酶标仪。
⑩塑料冲洗瓶。
⑪微量加样器。
⑫96孔微量滴定板。
2.实验步骤
①将已知抗原用ELISA包被缓冲液稀释至合适浓度(如5μg/mL),每孔加入100μL包被96孔微量滴定板(过量包被,每孔加入0.5μg抗原,高于酶标板每孔的最大吸附量50~100ng抗原,形成饱和吸附),封口膜封口,置于湿盒中,4℃包被过夜。
②用PBS-T洗板3次,每次5min,弃净洗液。
③每孔加入200μL封闭液,湿盒中室温孵育2h或37 ℃孵育1h。此步骤用于封闭孔中非特异的吸附位点。
④倒掉封闭液,用PBS-T洗板3次,每次5min,弃净洗液。
⑤加标准曲线样品:用2% BSA/PBS-T对标准品抗体进行倍比稀释,浓度分别为1000、500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.80ng/mL,加入标准曲线加样孔,每孔100μL。
⑥加待测样品:将待测样品用2% BSA/PBS-T按一定比例稀释(如1∶102、1∶103、1∶104、1∶105等)后,加入待测样品加样孔,每孔100μL。
⑦以上下两孔做同一待测样品的平行孔,前两孔作为阴性对照,仅加入100μL 2% BSA/PBS-T,其余孔依次加入梯度稀释的标准样品、待测样品,置于湿盒中,37 ℃孵育1h。
⑧倒掉抗体溶液,用PBS-T洗板3次,每次5min,弃净洗液。
⑨加入酶标二抗(预先用PBS-T把酶标二抗做一定比例稀释),每孔100μL,置于湿盒中,37 ℃孵育1h。
⑩倒掉酶标二抗,用PBS-T洗板3次,每次5min,弃净洗液,然后在吸水纸上拍干。
⑪显色:每孔加入100μL一定比例稀释的酶反应底物显色液,避光处静置10~30min。若显色时间过短,可能会降低实验的灵敏性,时间太长,则本底反应会增高,最长不可超过45min。
⑫每孔加入100μL终止液终止反应。
⑬在酶标仪中以一定波长测定光吸收值。
⑭以测定的OD值绘制线性回归标准曲线,其中标准蛋白浓度为横坐标,其对应的OD值为纵坐标,其相关系数R2应大于0.95,并用标准曲线的直线方程计算待测样品中抗体的浓度。
知识窗
酶免疫技术在生物医学研究中的应用实例
作为目前生物学研究中最常见及成熟的技术之一,酶免疫技术,特别是酶联免疫吸附(ELISA),被应用于大部分分子生物学实验中。在ELISA的工作原理基础上,有科学家发明了将ELISA与聚合酶链式反应(PCR)结合起来的PCR-ELISA技术。这个技术将标记后的核酸扩增产物与微孔中特定捕获探针杂交之后进行免疫检测,可以实现精确的核酸定量。2014年,S. Santiago-Felipe及A. Maquieira等(见参考文献[3])研究者使用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)代替PCR的RPA-ELISA技术,通过对食物中不同过敏原DNA的测定,从而实现对食物的安全检测。整个检测消耗时间较短(40min即可完成)、实验温度较低(40 ℃),对仪器要求很低,目视检测结果即可了解不同食物的安全性。图1-5所示为不同种类食品对不同安全检测项目的重组酶聚合酶扩增-酶免疫测试结果。图中检测孔内颜色越黄,则其对应的食品内过敏原含量越高。
图1-5 不同种类食品中安全相关因素的RPA-ELISA测试结果(本图彩印版见后附)
(A~F每一行对应一种待测食品,
1~10每一列对应一种不同安全性检测项目(如过敏原、转基因食品等))