EGFR突变基础上的小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFRTKis）开启了肺癌个体化治疗新时代，亦催生了后续多种分子靶向药物雨后春笋般进入临床前或临床研究，大有“忽如一夜春风来，千树万树梨花开”之景。然而，一个有生命力的靶向药物必须具备明确的靶基因、靶人群及有效的检测方法。而高效敏感的检测是实现精准治疗的基石与关键。

对肺癌驱动基因的深入研究导致了基因检测的巨大变革。尤其近年来以EGFR突变为代表的基因变异异质性和耐药的研究，使肿瘤界同仁认识到既往单一基因、单点静态和定性检测不能准确很好地反映异质性肿瘤内的多个亚克隆基因变异及其治疗选择过程中的动态改变规律。肺癌驱动基因的检测正在经历从单基因到多基因、从静态到动态、从定性到定量、从组织水平到单细胞水平的变革。

70%肺腺癌和50%以上肺鳞癌驱动基因已经确定。尽管大部分肺腺癌呈现单一驱动基因变异，但越来越多的研究显示部分患者肿瘤内存在遗传异质性，即初始肿瘤组织标本耐药基因以低频状态与驱动基因并存。随着治疗压力的选择作用，肿瘤细胞耐药克隆增加而导致临床耐药。初始标本中耐药基因存在与否影响患者靶向治疗的疗效和生存。另一方面45%肺鳞癌常常表现多个驱动基因变异或通路改变。因此仅仅进行单基因检测不能很好地反映肿瘤遗传学特点，多基因平行检测有助于确定肿瘤内的遗传异质性及治疗过程中驱动基因与旁路基因的动态转化过程。而且越来越多的基于分子靶药物的临床问世亦迫切需要建立多基因检测平台。

美国M.D.Andersong肿瘤中心牵头的BATTLE试验是国际上第一项进行多基因检测基础上的个体化靶向治疗研究。该研究对复治患者二次活检后进行EGFR、KRAS突变及VEGF，Cycling D检测，并根据分子检测结果相应给予厄罗替尼、索拉非尼、凡德他尼及厄罗替尼联合贝沙罗汀治疗，结果显示临床实践中重复活检是可行且8周疾病控制患者总生存时间延长。基于更多肺癌驱动基因检测基础上的个体化治疗研究（BATTLE II）正在进行中。

近期，美国肺癌突变联盟（LCMC）、法国肺癌生物标志物（BM）项目等多个协作组对肺腺癌和鳞癌进行多基因平行检测，在此基础上指导个体化策略的制定。在LCMC 项目公布的数据中，共有1000余例患者接受检测。其中，60%以上的患者可以鉴定出驱动基因突变。相较没有基因突变者及有突变但没有接受靶向治疗者，有驱动基因同时又接受靶向治疗者的中位生存时间显著延长。

与临床多基因检测的需要相呼应的是分子检测技术的革命性进展。如可进行多个热点突变检测的SNaPshot，SNP测序，下一代基因测序技术如全基因组/外显子组测序，转录组测序等在生物标本研究中的应用及检测价格的降低，为临床大规模基因平行检测提供了可行性和坚实的基础。

在不同治疗阶段或疾病进展过程中，肺癌的遗传学和表观遗传学特点可能发生改变，即存在时间分布上的肿瘤异质性，因此既往应用初治前的组织标本进行分子检测试图指导整个治疗过程的策略对部分患者并不合适，通过重复活检进行实时的基因分析才能更精准地反映治疗过程中细胞内各亚克隆的动态变化。

然而在临床实践中，反复进行组织活检无论从伦理或实际操作上均存在一定的难度。故利用外周血（游离DNA、循环瘤细胞等）建立实时、动态、无创、定量的分子检测体系具有重要的意义。著名的前瞻、随机、多中心临床研究FAST ACTⅡ的回顾性血浆DNA EGFR突变分析结果则表明以外周血为基础的基因检测指导个体化治疗指日可待。该研究在427例可用于分析的血浆标本中，32%（136/427）EGFR突变阳性。其中224例有配对组织标本，血浆检测的敏感性、特异性、两种标本的一致性分别为为77%（69/90），为96%（129/134），88% （198/224）。此数据与笔者所在团队既往的研究非常接近。尤其重要的是该研究显示血浆DNA EGFR突变对生存时间的预测与组织突变者高度一致。

这些研究结果表明外周血EGFR突变的假阳性率低，临床上一旦检测结果阳性，可以指导EGFR-TKIs的选择，但若检测结果阴性，有20%～30%可能性为假阴性。故未来的研究将致力于提高外周血EGFR突变检测的敏感性和对治疗预测的准确性。同时，基于目前的研究均为回顾性多中心或单中心研究，前瞻性多中心研究迫在眉睫。唯有如此，才能改写基于液体活检基础上的个体化治疗历史。

临床实践中，部分EGFR突变阳性患者EGFR-TKI治疗无效或效果不佳，其原因可能与EGFR突变含量或丰度有关。异质性高、EGFR突变含量低的肿瘤，可能更少从EGFR TKI治疗中受益。国内吴一龙教授团队利用标准的测序法和高敏的ARMS方法巧妙地将EGFR突变患者分为高丰度与低丰度组，发现两组患者EGFR TKI治疗疗效有显著差异，凸显出肿瘤内EGFR突变含量检测的重要性。

近年多组研究探寻EGFR-TKI敏感与耐压基因变异的定量检测。如北京大学肿瘤医院采用DHPLC法，通过观察峰值的变化对EGFR突变实现半定量分析。Azuara等利用纳米流体数字化PCR阵列（Nanofluidic digital PCR Array）定量分析结直肠肿瘤和胰腺肿瘤KRAS基因的变异状态，发现数字化PCR可提高KRAS等位基因突变的检测率。近期Oxnard等的研究亦发现利用数字化PCR检测肺癌血浆游离DNA EGFR突变量的改变能很好预测治疗疗效，且耐药基因的出现能在改变前影像学改变前16周即已出现。北京大学肿瘤医院亦利用数字化PCR，对135例EGFR-TKIs初始治疗有效6个月以上而后治疗失败的晚期NSCLC 的配对外周血标本进行了EGFR突变及T790M突变的定量、动态分析，在一定程度上表明基因变异在瘤灶内的异质性。除数字化PCR外，BEAMing检测、下一代基因测序技术等均能对异质性肿瘤的基因变异进行定量分析。这对实现精准的个体化治疗无疑具有重要的意义。

CTC是有关外周血分子标志研究的焦点，作为完整的、无损伤的肿瘤细胞，能反映肿瘤的转移、耐药、进展等过程。既往的研究更多聚焦于乳腺癌、前例腺癌、肠癌治疗前后CTC的数量或单一基因如Her2等的变化与疗效、预后的关系。肺癌CTC的研究滞后于上述几种肿瘤，主要涉及数量变化的预测意义。近期哈佛大学Yu博士分析乳腺癌CTC的上皮间质转化（EMT）与其化疗或靶向治疗的关系，发现CTC中EMT比例增高者治疗反应差于上皮标志高的患者。而大部分肿瘤微量的CTC是进行基因组分析的最大挑战。

近期笔者所在团队与哈佛大学和北京大学生命研究科学院的谢晓亮教授合作，进行晚期肺癌CTC单细胞基因组和外显子组分析，试图探寻肺癌靶向治疗耐药、转移、甚至表型转化的机制。该研究成功检测到与肺癌发生发展密切相关的原癌基因和抑癌基因上的重要单核苷酸变异和插入/缺失。结果显示CTC中外显子组突变的异质性虽然明显，但与肿瘤耐药或表型转化相关的基因变异在CTC中高度富集。故单细胞水平CTCs的基因突变的检测不仅可避免反复穿刺活检给患者带来的伤害和痛苦，并能及时提供个体化治疗所需的重要信息。

此外，该研究还发现肺腺癌中，来自同一患者不同CTC均展现出高度一致的全基因组拷贝数变化模式，与其转移灶组织的基因拷贝数变化模式一致。而不同的肺腺癌患者中，CTC展示的全基因拷贝数变化模式具有高度的相似性。肿瘤的异质性长期以来被视为恶性肿瘤的重要特征。首次在CTC中观察到的高度一致的拷贝数变异模式将会改变传统上对肿瘤异质性的理解，揭示特定的拷贝数变异在肿瘤形成及转移中发挥重要的作用。有可能作为肺癌早期诊断或复发转移的分子标志。

综上，随着组织病理学到分子病理学的发展，NSCLC不再被认为是一个疾病而是由不同驱动基因作用的一组疾病。驱动基因的发现对肺癌个体化治疗有重要的指导价值。在这些生物标记物中EGFR突变、ALK融合基因目前证据最为有力。而检测技术的变革已经并将继续推动肺癌个体化精准治疗的深入发展：“从单基因到多基因、从肿瘤组织到单细胞”的检测变革”，使在临床实践中能更充分地利用有限的肿瘤标本获得更多的可指导个体化治疗的信息；“从静态到动态”的检测变革，使对靶向治疗的疗效和耐药监测成为可能；而“从定性到定量”的检测变革，则有助于更深入地了解NSCLC异质性，指导更为合理的治疗策略的制定。